27-羥基膽甾醇誘導人神經母細胞瘤細胞凋亡的調控機制

朱夢嬌 黃燕燕 曹立 唐維國

27-羥基膽甾醇（27-OHCH）是一種典型的膽固醇氧化代謝產物，能自由通過血腦屏障而進入腦內，從而影響腦中髓鞘形成及神經退行性疾病的發生[1-2]。痙攣性截癱5型（SPG5A）的致病基因膽固醇7α羥化酶（CYP7B1）基因發生突變[3]，會引起神經中樞神經甾體代謝和肝內膽固醇旁路代謝異常，主要表現在肝臟對27-OHCH、在神經中樞對脫氫表雄酮（DHEA）進行羥化反應異常[4]。Schüle等[5]發現SPG5A患者血清中27-OHCH濃度是對照組的6～7倍，攜帶者與正常對照者差異無統計學意義；SPG5A患者腦脊液中27-OHCH濃度是對照組的30～50倍，但腦脊液中氧化型膽固醇等指標均正常。此外，動物實驗研究表明，CYP7B1基因敲除的3月齡小鼠腦脊液中27-OHCH濃度明顯高于野生型小鼠[6]。SPG5A患者和CYP7B1基因敲除小鼠腦脊液中27-OHCH濃度明顯升高，提示27-OHCH濃度升高可能是SPG5A發病的重要因素。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路是參與細胞生長、增殖及死亡調控的重要通路之一[7]。中度或不持續的AKT活化能抑制細胞凋亡，通過各種下游效應分子促進細胞生長和血管生成；相反，AKT的過度激活會引發細胞衰老和凋亡[8]。27-OHCH能促使神經細胞生成β-淀粉樣蛋白明顯增多[9-10]，上調Caspase-12，從而影響線粒體膜電位，使得活性氧自由基（ROS）蓄積，引起細胞凋亡[11-13]；但具體調控機制目前尚未闡明。本研究將AKT抑制劑LY294002作用于人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y），封閉PI3K/AKT信號通路，觀察27-OHCH的細胞毒效應是否受其影響，進而探索27-OHCH誘導細胞凋亡的機制，為進一步揭示SPG5A的發病機制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞來源及培養 SH-SY5Y細胞購于中國科學院上海細胞庫。用含10%FBS的RPMI 1640培養基，置37℃、5%CO2孵育箱中傳代培養。

1.2 試劑及儀器 27-OHCH（英國Tocris Bioscience公司），以無水乙醇作為溶劑配置成20mM母液，置-20℃保存備用；RPMI 1640培養基、含 FBS的 DMSO、ACCUTASETM細胞消化液（美國Gibco公司）；抑制劑LY294002、DAPI染液、CCK-8試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；0.45μm硝酸纖維素膜（美國Millipore公司）；Annexin V-PE/7-AAD試劑盒（美國BD Sciences公司）；AKT、磷酸化 AKT（p-AKT）、Caspase-9、β-actin 等抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率 取5×104個/ml對數生長期細胞接種于96孔板，設置不同濃度（3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM）27-OHCH 處理組、溶劑對照組（添加與27-OHCH處理組相應濃度的無水乙醇）、空白組（孔內不加細胞，僅加細胞培養液）、陰性對照組（孔內加細胞，但不添加27-OHCH），每組6個復孔，分別作用24、48h后，吸去舊培養基；將培養基與CCK-8試劑按10∶1混勻，每孔加入100μl混合試劑；將培養板置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中避光孵育2h；利用酶標儀于450nm處測定吸光度（A）值。利用公式計算細胞存活率，細胞存活率=[（A27-OHCH處理組-A空白組）/（A溶劑對照組-A空白組）]×100%。

1.4 細胞形態觀察 取1×105個/ml對數生長期細胞接種于φ14mm細胞爬片，次日加入不同藥物濃度的27-OHCH。設置不同濃度的27-OHCH處理組，AKT通路抑制劑組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、陰性對照組，其中27-OHCH的濃度為 12.5、25.0μM；作用 48h 后，甲醛固定 10min，DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態。

1.5 Western blot法檢測細胞內 p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表達 取1×105/ml對數生長期細胞接種于24孔板，設置27-OHCH處理組、AKT通路抑制組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、空白對照組，其中27-OHCH的濃度為0、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM。作用 48h 后用細胞裂解液裂解細胞，取蛋白樣品約15μl，經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜于0.45μm硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃過夜；TBST緩沖液洗膜3次，10min/次；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1h；TBST緩沖液洗膜3次，10min/次；將膜置于ECL化學發光劑中，用X線膠片曝光、顯影及定影；以β-actin作為內參，應用Quantity one軟件計算各WB條帶的灰度值。

1.6 Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取1×105個/ml對數生長期細胞接種于24孔板，設置不同濃度的27-OHCH處理組、AKT通路抑制組（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同濃度的27-OHCH）、無水乙醇溶劑對照組、無水乙醇+DMSO溶劑對照組，其中27-OHCH的濃度為12.5、25.0μM。利用ACCUTASETM細胞消化液消化細胞；800r/5min離心收集細胞，將細胞重懸于100μl結合液中；加入5μl Annexin V-PE和5μl 7-AAD，避光、室溫孵育15min；FACS Calibur流式細胞儀上機檢測，應用FlowJo軟件分析細胞凋亡率。Annexin V-/7-AAD-為活細胞，Annexin V+/7-AAD-為早期凋亡細胞，Annexin V+/7-AAD+為晚期凋亡細胞或壞死細胞；其中Annexin V+/7-AAD-、Annexin V+/7-AAD+為凋亡細胞。

1.7 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 27-OHCH對SH-SY5Y細胞存活率的影響 給藥24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 SH-SY5Y 細胞存活率均較陰性對照組明顯降低，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）；給藥 48h，不同濃度（3.125～50.0μM）27-OHCH處理組SH-SY5Y細胞存活率均較陰性對照組明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。提示隨著27-OHCH濃度增加或給藥時間延長，SH-SY5Y細胞存活率均明顯下降，見圖1。

圖1 27-OHCH對SH-SY5Y細胞存活率的影響（與陰性對照組比較，*P＜0.05）

2.2 AKT抑制劑逆轉27-OHCH細胞毒效應的形態學觀察 在光學顯微鏡下，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組作用48h后，SH-SY5Y細胞數量較陰性對照組明顯減少，細胞形態發生明顯變化（細胞皺縮變圓，貼壁能力減弱），隨著27-OHCH濃度增加，變化越明顯。DAPI染色結果顯示，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組SH-SY5Y細胞核出現明顯的凋亡現象（核內染色質不規則凝集，細胞核破碎成塊狀或半月狀，凋亡小體出現），隨著27-OHCH濃度增加，凋亡現象越明顯。與相同濃度的27-OHCH處理組比較，在光學顯微鏡下AKT通路抑制組SH-SY5Y細胞數量增多，細胞形態較好；在熒光顯微鏡下細胞核凋亡現象有所減弱，見圖2。

圖2 AKT抑制劑逆轉27-OHCH細胞毒效應的形態學觀察[a：陰性對照組；b：27-OHCH（12.5μM）處理組；c：27-OHCH（25.0μM）處理組；d：LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）組；e：LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）組]

2.3 27-OHCH對SH-SY5Y細胞內p-AKT、cleavedcaspase-9蛋白表達的影響 隨著27-OHCH處理組濃度的增加，SH-SY5Y細胞內p-AKT（Ser 473）表達逐漸增強，見圖 3a；經定量分析，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH處理組SH-SY5Y細胞內p-AKT（Ser 473）表達水平較陰性對照組均明顯升高（均P＜0.05），見圖4。12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 SH-SY5Y 細胞內cleaved-caspase-9（37/35kD）表達明顯增強，見圖 3b。經AKT抑制劑預作用后，不同濃度（0～50.0μM）27-OHCH處理組p-AKT（Ser 473）表達均受抑制，見圖3c；而12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 處理組 cleaved-caspase-9蛋白表達變化不明顯，見圖3d。提示27-OHCH能引起SHSY5Y細胞凋亡，AKT通路可能在其中發揮作用。

圖3 27-OHCH對SH-SY5Y細胞內p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表達的電泳圖

圖4 不同濃度27-OHCH處理組SH-SY5Y細胞內p-AKT（Ser 473）表達水平（與陰性對照組比較，*P＜0.05）

2.4 AKT抑制劑逆轉27-OHCH細胞凋亡誘導的作用給藥48h，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組均能引起SHSY5Y細胞凋亡效應，細胞凋亡率分別為（24.04±0.83）%和（42.95±3.89）%，均高于無水乙醇溶劑對照組的（9.44±0.32）%（均 P＜0.05）。AKT 抑制劑預作用 2h能逆轉細胞凋亡效應，LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）組細胞凋亡率為（16.03±0.39）%，明顯低于 12.5μM 27-OHCH 處理組（P＜0.05）；LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）組細胞凋亡率為（22.77±1.83）%，明顯高于無水乙醇+DMSO 溶劑對照組的（11.05±0.61）%（P＜0.05），但明顯低于 25.0μM 27-OHCH 處理組（P＜0.05），見圖5。提示AKT抑制劑能逆轉27-OHCH對SH-SY5Y細胞凋亡的誘導作用。

圖5 Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

3 討論

27-OHCH是外周細胞內膽固醇側鏈被氧化的主要羥固醇產物之一，可通過血腦屏障入腦。研究發現SPG5A患者腦脊液中的27-OHCH濃度明顯升高，經無膽固醇飲食或長期鵝去氧膽治療，可能降低神經甾體的濃度，從而改善或穩定SPG5A患者癥狀[5，14]。相關研究發現，阿爾茨海默病（AD）患者大腦27-OHCH濃度較正常對照組急劇升高[15]。血漿膽固醇水平升高能使羥固醇入腦增多，影響神經細胞的正常結構及功能，進而引起β-淀粉樣蛋白增多，進一步影響AD的發生、發展[16-17]。可見，27-OHCH濃度異常與中樞系統神經退行性疾病可能有關[3-4]。Prasanthi等[10]發現27-OHCH作用于SH-SY5Y細胞后，該細胞表達增強，與AD發病機制相關蛋白如β-淀粉樣蛋白、磷酸化Tau蛋白水平亦明顯升高。此外，研究表明27-OHCH作用于SH-SY5Y細胞后，α-突觸核蛋白水平明顯升高，從而引起ROS蓄積、炎癥損傷、細胞凋亡[11-13]。本研究結果發現，27-OHCH能誘導 SH-SY5Y 細胞凋亡，給藥 24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH處理組細胞存活率均明顯降低；給藥48h，各藥物濃度均可導致SH-SY5Y細胞存活率降低。熒光顯微鏡下細胞形態學觀察與Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀檢測發現，12.5、25.0μM 27-OHCH處理組能誘導SH-SY5Y細胞凋亡，使細胞數量減少。目前尚無研究涉及27-OHCH的調控機制，因此，筆者就27-OHCH誘導SH-SY5Y細胞毒效應的信號通路作一研究。

PI3K/AKT信號通路是細胞生存的重要信號通路之一，它在細胞增殖、分化及死亡等方面起著重要作用。AKT是PI3K下游的效應分子，PI3K結合AKT的PH結構域能使AKT從細胞質向細胞膜轉位，并改變其構象，使得AKT Thr 308或Ser 473位點發生磷酸化，從抑制狀態變為激活狀態[12]。中度或不持續的AKT活化能抑制細胞凋亡，通過各種下游效應分子促進細胞生長和血管生成[18-19]。然而，AKT的過度激活會引發細胞衰老和凋亡，主要機制是通過增加胞內ROS產量，抑制FoxO轉錄因子并下調其下游抗氧化酶MnSOD、過氧化氫酶等表達[8]。Nogueira等[20]發現細胞AKT的活化程度越高，對ROS誘導的凋亡效應越靈敏。更有以此為基礎，通過雷帕霉素過度激活癌細胞AKT活化水平，達到消除腫瘤細胞的目的[21]。本研究發現濃度遞增的27-OHCH（3.125～50.0μM）作用于 SH-SY5Y 細胞，隨著細胞內AKT活化水平的增加，細胞凋亡程度明顯增強，推測27-OHCH誘導的細胞凋亡效應與AKT過度活化相關。此外，顯微鏡下觀察、Western blot和流式細胞儀檢測結果均表明AKT通路抑制劑LY294002能逆轉27-OHCH誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

綜上所述，27-OHCH通過PI3K/AKT信號通路誘導細胞毒效應。本研究對該調控通路的探討，為最終揭開27-OHCH相關神經退行性疾病病因、尋找有效的臨床治療方法及靶點提供了新方向。