肺炎球菌DNA負荷、降鈣素原和suPAR水平與肺炎鏈球菌感染程度的相關性研究

何雨峰 段金秋 黃 雪 董恒利 李寧俠*

肺炎是終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，可由細菌、真菌、寄生蟲等致病微生物引起，細菌性肺炎占各類肺炎的80%，以肺炎球菌感染多見[1]。肺炎鏈球菌的檢測可通過痰和(或)血培養、Gram染色、尿抗原檢測或定量熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)，PCR)等方式，痰和(或)血培養生物體分離困難，陽性率較低，檢查前抗生素的應用也會降低敏感性。尿抗原檢測在不同研究中的結論尚不一致，定量熒光PCR反應可通過對非培養樣本進行快速準確的定量分析，檢測肺炎球菌的DNA負荷(LytA基因)，有助于對疾病嚴重程度和病死風險的評估[2-3]。降鈣素原(procalcitonin，PCT)是感染的特異性標志物，常用于細菌感染的輔助診斷和病情評估[4]。尿激酶型纖溶酶激活物受體(urine kinase plasminogen activator receptor，uPAR)是單鏈膜糖蛋白，物理條件下表達于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞、激活的T細胞等表面，在腫瘤和炎癥等病理條件下，uPAR脫落成為可溶性uPAR(soluble urokinase plasminogen activator receptor，suPAR)，監測suPAR水平研究疾病病程已經成為重要研究方向[5]。本研究探討采用PCR法檢測血液肺炎球菌DNA負荷(LytA)量、PCT和suPAR水平，觀察三者與肺炎球菌感染患者病情嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月至2018年2月在西安醫學院第二附屬醫院就診的184例肺炎鏈球菌感染患者，其中男性103例，女性81例；年齡23～68歲，平均年齡(52.37±11.45)歲。按照肺炎嚴重度指數(pneumonia severity index，PSI)進行分級，其中Ⅰ級30例，Ⅱ級41例，Ⅲ級68例，Ⅳ級30例，Ⅴ級15例。依據病情嚴重程度將患者分為輕度組(71例)，中度組(68例)和重度組(45例)。所有患者在性別、年齡、體質量指數等一般資料相比差異均無統計學意義，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準:①痰培養肺炎鏈球菌感染；②年齡≥18歲，性別不限；③急性起病，之前未進行過藥物治療；④對研究知情并簽署知情同意書。

(2)排除標準:①細菌、支原體及病毒混合感染者；②合并其他部位炎癥、肺結核、惡性腫瘤及其他重大疾病者；③合并精神、智力及思維異常者；④擬納入或已納入其他臨床研究者。

1.3 儀器與試劑

采用TaqMan7500系統(Applied Biosystems，Foster City，CA，美國ABI公司)；SDS 7500 Fast System Software v1.5.1.熒光定量PCR分析軟件(美國ABI公司)；suPAR試劑盒購于美國ADL公司；PCT分析儀及試劑盒均購自德國BRAHMS公司；QuaAMP DNA Mini Kit核酸提取套盒(荷蘭Qiagen公司)。

1.4 研究方法

患者入組后，收集2 ml靜脈血加入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，室溫保持24 h，用于DNA分離，參照Peter等[7]改良的方法進行肺炎球菌DNA分離，1 ml血樣采用QuaAMP DNA Mini Kit核酸提取套盒根據使用指導進行DNA提取，采用50 μl洗脫緩沖液洗脫提取的DNA，采用TaqMan7500系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)擴增DNA，采用LytA基因引物進行肺炎鏈球菌特異性檢測，已知肺炎球菌負荷量的標本用于量化，LytA基因引物序列:LytA FW 5＇-ACGCAATCTAGCAGATGAAGC-3＇LytA RV 5＇-TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC-3＇，LytA probe5＇-FAMTTTGCCGAAAACGCTTG ATACAGGG-BHQ1-3＇，實時定量熒光PCR反應條件:95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，45循環，45 ℃，1 min，45循環，采用SDS 7500 Fast System Software v1.5.1熒光定量PCR分析軟件分析，如測序成功則認為結果陽性。采用半定量免疫色譜法檢測PCT水平。

1.5 觀察與判定指標

采用PSI評分[6]進行病情評價，PSI包括年齡、性別、基礎疾病、生命體征異常、實驗室檢查異常、胸腔積液等維度組成，PSIⅠ級為≤50分，Ⅱ級為51～70分，Ⅲ級為71～90分，Ⅳ級為91～130分，Ⅴ級為＞130分，Ⅰ～Ⅱ級提示為輕度肺炎，Ⅲ級提示為中度肺炎，Ⅳ級和Ⅴ級提示為重度肺炎。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0進行統計學數據處理，計量資料采用均數±標準差(x-±s)表示，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法，相關性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同病情分級患者LytA、PCT和suPAR水平相比較

3組患者LytA陽性率相比差異無統計學意義(F=1.900，P＞0.05)；LytA、PCT和suPAR水平隨著病情分度增加逐漸升高，3組比較差異均有統計學意義(F=62.057，F=73.892，F=48.509；P＜0.05)，見表1。

2.2 LytA、PCT及suPAR水平與病情嚴重程度相關性分析

相關性分析顯示，LytA、PCT及suPAR水平與肺炎球菌感染患者病情嚴重程度均呈顯著正相關(r=0.472，r=0.506，r=0.438；P＜0.05)；LytA量與PCT、suPAR水平呈顯著正相關(r=0.603；r=0.682；P＜0.05)。

3 討論

肺炎是導致患者住院和死亡的重要原因，目前雖然多種方法可用于病原菌的分離和鑒定，但患者疾病嚴重程度分類存在一定困難。肺炎從輕癥至重癥差別較大，初始抗菌藥物選擇、實驗室檢查強度、是否需要住院或住ICU等措施均與病情嚴重程度密切相關，而正確的病情分度可指導臨床醫師的診療工作[8-9]。PSI是最常用的臨床評分系統，其初衷是為了準確預測肺炎患者的病死率，但PSI評分是由包括年齡、基礎疾病、體征、實驗室檢查等4個維度的20個變量組成，評分標準和分數計算過于復雜和繁瑣，不利于臨床醫師臨床實際運用，且年齡在PSI中所占比重較大，易對年輕患者的病情嚴重程度評估不足[10]。因此，探討可客觀反映肺炎病情嚴重程度的指標成為臨床研究的熱點。

表1 三組患者LytA、PCT和suPAR水平相比較(s)

表1 三組患者LytA、PCT和suPAR水平相比較(s)

注：表中LytA為肺炎球菌DNA負荷；PCT為降鈣素原；suPAR為可溶性尿激酶型纖溶酶激活物受體；

檢測指標水平LytA×102genomes/ml PCT(ng/ml) suPAR(ng/ml)輕度組 71 61(85.92) 2.35±2.05 4.38±2.97 2.08±1.25中度組 68 62(91.18) 4.69±3.18 6.92±3.14 3.85±1.46重度組 45 42(93.33) 7.45±4.47 9.40±3.82 4.99±2.05 F值 1.900 62.057 73.892 48.509 P值 0.387 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 例數 LytA陽性率[例(%)

患者的血培養至少需要24～48 h，而PCR可在4 h內得出檢查結果，與血培養相比較具有明顯優勢。Said等[2]研究顯示，成人肺炎患者血液中肺炎球菌LytA陽性率為25%；Loonen等[11]研究顯示，成人肺炎中LytA陽性率為20%；Peters等[12]研究顯示，血培養結果在肺炎鏈球菌的成年患者中，PCR檢測LytA的陽性率為82%。

本研究結果顯示，輕度、中度及重度患者PCR檢測LytA陽性率分別為85.92%、91.18%和93.33%，高于有關報道[2，11]；且與以下因素有關:①LytA受血液中細菌負荷影響，細菌負荷過低，則不易通過血液和PCR獲得，與Said等[2]和Loonen等[11]研究相比較，本研究納入病例為血培養陽性患者，Rello等[13]研究亦顯示，血培養陽性患者PCR檢測陽性率高；②LytA受抗生素影響有關，如在抽取血液標本前給予抗生素則可能降低LytA基因表達，本研究納入病例將給予抗生素患者排除。

本研究結果顯示，隨著疾病嚴重程度的增加，LytA逐漸增加，相關性研究顯示，肺炎球菌DNA負荷與疾病嚴重程度呈正相關，結果提示，肺炎球菌DNA負荷增加預示細菌負荷增加，是導致疾病加重的關鍵因素[14]。

PCT是臨床常用的炎性標志物，通常血清PCT濃度＞0.5 ng/ml即認為有細菌感染，其水平在細菌性肺炎的診斷和預后判定中具有重要臨床價值，已經得到多個臨床研究證實[15-16]。本研究結果顯示，所有組別肺炎球菌感染患者血清PCT水平均高于0.5 ng/ml，且隨著病情嚴重程度增加，其水平呈增加趨勢，與李艷麗[15]和蔡錦洪[16]研究一致。近年來的研究顯示，suPAR可通過調節細胞黏附、促進白細胞遷移、參與細胞外基質蛋白等機制參與細菌感染性炎癥的發生和發展，可預測患者細菌感染的嚴重程度、預后和病死風險，被認為在全身炎癥反應性綜合征的診斷和嚴重度評估中具有重要價值[17]。Sawa等[18]研究顯示，suPAR是肺炎預后的獨立預測因子，與傳統的炎性標志物和X射線相比較，提示肺炎的病情嚴重程度和預后具有更高的臨床價值。本研究結果顯示，suPAR水平與患者病情嚴重分度呈正相關，結果與Sawa等[18]的研究一致。本研究結果顯示，LytA基因與PCT和suPAR均有良好的相關性，且LytA基因對預測疾病嚴重程度具有良好價值。

肺炎球菌肺炎患者血液LytA基因與患者的疾病嚴重程度及傳統指標PCT和新型指標suPAR均有良好的相關性，但本研究僅探討了血培養陽性患者LytA基因與疾病嚴重程度的相關性，對血培養陰性患者的臨床價值尚需要進一步研究探討。