羊角槭愈傷組織誘導、增殖與分化

胡佳卉，王小德

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州311300）

羊角槭Acer yangjuechi是槭樹科Aceraceae槭屬Acer落葉喬木。該種僅分布于浙江西天目山狹窄的范圍，生長于海拔700 m的疏林中［1］，為浙江省特有種，其數量極少，長勢衰退。羊角槭種子繁殖能力低，天然更新能力較弱，已經陷入滅絕的險境，是中國僅存10株以下的珍稀植物之一［2］，被列為國家二級保護植物。羊角槭系古老的殘遺種，與產自日本的日本羊角槭Acer myabei關系密切，對研究東亞植物區系的起源、演化以及古氣候、古地理變遷具有重要價值。植物組織培養技術對物種種質保存、植物育種等方面具有促進作用。目前，國內對羊角槭的研究主要包括種子生物學特征的測定以研究種子深度休眠的原因［3］、 光能和水分利用效率［4］、 基因組DNA提取［5］及葉綠素熒光特性研究［6］等方面， 而以羊角槭外植體為材料進行愈傷組織誘導及植株再生方面的研究還未見報道。為解決羊角槭繁殖系數低、繁殖速度慢，優良品種的推廣與培育受到限制，無法滿足大規模生產需要的問題，以羊角槭的嫩莖和葉片為外植體材料，研究了不同消毒方法、不同基本培養基及不同植物生長調節劑組合對羊角槭愈傷組織的誘導、增殖及分化的影響，篩選出最適宜誘導愈傷組織的外植體及培養基配比，為建立羊角槭高效的快繁技術體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以5～6年生羊角槭當年生幼嫩莖段和葉片為外植體。試驗在浙江農林大學園林學院組培室進行，樣品于2017年4－6月采自浙江農林大學珍稀植物園。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理及消毒 天氣晴朗的清晨，剪取生長狀況良好、無病蟲害的羊角槭當年生幼嫩莖段和葉片，裝袋帶回實驗室備用。用流水輕輕洗凈表面污漬，后用洗潔精溶液浸泡5 min，漂凈后用流水沖洗2 h，瀝干水后置于超凈工作臺，用體積分數為75%的乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3～5遍，后再用1.0 g·kg－1的氯化汞（HgCl2）浸泡消毒，葉片消毒8 min，莖段消毒10 min，無菌水沖洗3～5遍，消毒完后用無菌濾紙吸干表面水分，在超凈工作臺上將葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的方塊，莖段切成0.5～1.0 cm的小段待接種。

1.2.2 外植體取樣時間選擇 分別于4月（處理1）和6月（處理2）剪取生長狀況良好、無病蟲害的羊角槭幼嫩莖段和葉片，處理消毒后接種于木本植物培養基（WPM培養基）+0.5 mg·L－16-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+0.3 mg·L－1萘乙酸（NAA）的培養基中， 接種 15 瓶·處理－1， 接種外植體 2 個·瓶－1， 重復 3 次， 7 d 后統計不同月份取樣的存活率、污染率。

1.2.3 外植體消毒方法選擇 為確定外植體最佳消毒方法，選擇乙醇30 s+氯化汞8 min（處理1），乙醇30 s+氯化汞10 min（處理2），乙醇30 s+氯化汞12 min（處理3）3種消毒方法對羊角槭外植體進行表面消毒，消毒完后接種于 WPM+0.5 mg·L－16-BA+0.3 mg·L－1NAA 的培養基中， 接種 15瓶·處理－1，接種外植體2個·瓶－1，重復3次，7 d后統計污染率,30 d后統計誘導率。

1.2.4 外植體類型對誘導的影響 分別以羊角槭的嫩莖（處理1）和嫩葉（處理2）為外植體，消毒處理后接種于 WPM+0.5 mg·L－16-BA+0.3 mg·L－1NAA 的培養基中， 接種 15 瓶·處理－1， 接種外植體 2 個·瓶－1，重復3次，30 d統計愈傷組織誘導情況。

1.2.5 愈傷組織誘導最佳培養基篩選 以1/2MS，MS和WPM為基本培養基，植物生長調節劑選擇NAA（0.1， 0.2， 0.3 mg·L－1）， 激動素（KT）（0， 0.5， 1.0 mg·L－1）， 6-BA（0.5， 1.0， 1.5 mg·L－1）， 根據L9（3）4設計四因素三水平正交試驗表，共配置9組培養基，另配置3組只添加基本培養基不添加任何植物生長調節劑的培養基作為對照（表1），接種15瓶·處理－1，接種外植體2個·瓶－1，重復3次，30 d后統計愈傷組織誘導情況。愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體總數×100%。

1.2.6 愈傷組織增殖最佳培養基篩選 根據愈傷組織誘導結果，選取WPM+1.0 mg·L－16-BA為培養基固定成分，分別添加0，0.05，0.10，0.15 mg·L－1的NAA，將誘導出的生長較好的愈傷組織切成大小相近的顆粒，接種到增殖培養基中，30 d后測定愈傷組織的鮮質量增量，統計增殖倍數。愈傷組織增殖倍數=培養后愈傷組織質量/接入時愈傷組織質量。

1.2.7 愈傷組織分化最佳培養基篩選 以WPM為基本培養基， 1.0 mg·L－16-BA+0.1 mg·L－1NAA 為固定植物生長調節劑成分，分別添加0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L－1的TDZ，將誘導及增殖出的生長較好的愈傷組織切成大小相近的顆粒，接種到分化培養基中，30 d后統計出芽數及分化率。愈傷組織分化率=分化出芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織總數×100%。

表1 誘導培養各因素質量濃度設置Table 1 Concentration of various factors about induction

1.3 培養條件

所有培養基均添加蔗糖 30 g·L－1， 瓊脂粉 7 g·L－1， 調節 pH 值至 pH 5.8， 并在 121 ℃，1.1 kg·cm－2壓力下高溫高壓滅菌 20 min待用。培養基接種外植體2個·瓶－1，接種15瓶·處理－1，3次重復。接種后的材料在光照強度2 000 lx，光照12 h·d－1，溫度（25±2）℃的培養室中進行培養。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行方差及極差分析［7］，對于差異顯著者采用Tukey多重比較，字母法標記；作圖在Excel軟件下完成。

2 結果與分析

2.1 外植體取樣時間選擇

處理1的外植體污染率為11.5%，處理2同樣消毒方法處理的外植體接種后污染率為61.7%（表 2），顯著（P＜0.05）高于處理 1， 且處理1的愈傷組織膨大早、生長速度較快，而處理2的愈傷組織生長較為緩慢，說明4月為羊角槭嫩莖嫩葉采樣的最佳時期。

表2 不同取樣時間的污染率Table 2 Contamination rate at different sampling times

2.2 外植體消毒方法選擇

3種處理污染率存在顯著差異（P＜0.05），從高到底依次為處理1，處理2和處理3，污染率分別為25.0%，20.6%和4.7%，而3種處理的誘導率也存在顯著差異（P＜0.05），從高到低依次是處理2，處理3和處理1，誘導率分別為79.1%，68.3%和67.8%（表3）。隨著氯化汞消毒時間的增加，污染率依次降低，誘導率先升高后降低，說明適當時間的氯化汞消毒有利于防治外植體污染，但消毒時間過長可能導致外植體失去生活力從而抑制誘導。綜合污染率和誘導率來看，羊角槭外植體最適合的消毒方法為體積分數為75%的乙醇30 s+1.0 g·kg－1氯化汞10 min。

表3 不同消毒方法的污染率和誘導率Table 3 Contamination rate and Induction rate by different disinfection methods

2.3 外植體類型對誘導的影響

不同的羊角槭外植體接種到相同的培養基上，第7天后莖段開始膨大，從切口處慢慢開始出現瘤狀物，葉片在第5天后開始卷曲，在第18天后切口靠近葉脈處開始出現顆粒狀物，且極為細小。30 d后統計結果如表4所示:莖段和葉片的誘導率存在顯著差異（P＜0.05），莖段的誘導率為54.7%，葉片的誘導率為34.0%，莖段愈傷組織顆粒大、愈傷量多，葉片雖也有一定程度的愈傷量，但愈傷組織顆粒小、不能成塊。由此可見，莖段是羊角槭愈傷組織誘導的最佳外植體。

表4 不同外植體的出愈數與誘導率Table 4 Amount of callus and induction rate of different explants

2.4 愈傷組織誘導最佳培養基篩選

不同基本培養基［8］和植物生長調節劑組合均對羊角槭愈傷組織的誘導有不同程度的促進作用。從不同外植體來看，莖段愈傷組織誘導率高于葉片愈傷組織，莖段膨大產生顆粒較大的淡黃色或略偏紅色的或緊致或疏松的愈傷組織，葉片蜷縮，且僅在靠近葉柄的位置長出淡青色的顆粒極小的愈傷組織，均不利于繼代增殖。莖段在添加了植物生長調節劑的培養基中均誘導出愈傷組織，愈傷誘導率為21.17%～62.90%，愈傷組織的數量及形態方面存在差異。1～3號誘導出的愈傷組織偏紅色，呈小顆粒狀，愈傷發生量較少，4～6號誘導出的愈傷組織呈白淡黃色，質地松軟，顆粒較大，7～9號誘導出的愈傷組織呈淡黃色淡綠色，大顆粒狀，有致密有松軟。

表5顯示：基本培養基對愈傷組織誘導率有顯著影響（P＜0.05），NAA，KT和6-BA對愈傷組織誘導率的影響不顯著，但影響程度略有差異，從高到低依次為6-BA，NAA和KT。綜合表5數據可得，最適宜于羊角槭愈傷組織誘導的培養基為 WPM+0.3 mg·L－1NAA+0.5 mg·L－1KT+0.5 mg·L－16-BA。

表5 愈傷組織誘導正交試驗結果Table 5 Orthogonal design and results for callus induction

2.5 愈傷組織增殖最佳培養基篩選

由表6可知：植物生長調節劑對愈傷組織的增殖有促進作用。當6-BA質量濃度不變時，愈傷組織的增殖倍數隨著NAA質量濃度的增加先變大后減小，不添加NAA的處理組增殖不明顯，4個處理之間增殖倍數差異不顯著（P＞0.05），添加0.1 mg·L－1NAA的處理3增殖倍數最大，為2.40，增殖效果最佳，愈傷組織膨大最明顯，新產生呈淡綠色的愈傷組織。由此可見，最適宜于羊角槭愈傷組織增殖的培養基為WPM+1.0 mg·L－16-BA+0.1 mg·L－1NAA。

2.6 愈傷組織分化最佳TDZ質量濃度篩選

將生長良好的愈傷組織分別接種到TDZ質量濃度不同的4種處理培養基中誘導不定芽，培養30 d后，4種處理培養基中均無明顯的不定芽產生，但其生長情況有所不同。4種處理中愈傷組織均有增殖膨大，表面有顆粒狀突起，產生或淺綠色或白綠色的芽點，處理2新增愈傷組織呈深紅褐色，處理3呈淺綠色。4種處理中，隨著TDZ質量濃度的增加，產生的芽點數量也隨之增加，說明TDZ質量濃度對愈傷組織的分化有一定影響，較高質量濃度的TDZ能促進愈傷組織產生較多不定芽芽點，對愈傷組織分化有促進作用。

3 結論與討論

3.1 結論

本研究分別在4和6月進行羊角槭愈傷組織誘導。結果表明：4月愈傷組織生長快、出愈率大、污染率低。4月正值羊角槭生長季節，較6月更適宜做愈傷組織誘導試驗。在外植體消毒試驗中，選用了乙醇與氯化汞不同消毒時間的組合。根據培養后外植體的污染率和誘導率，得出羊角槭外植體最佳消毒方法為體積分數為75%乙醇消毒30 s+1.0 g·kg－1氯化汞消毒10 min。根據培養后愈傷組織生長情況可知，最適宜于羊角槭愈傷組織誘導的外植體是其嫩莖，嫩莖愈傷組織誘導率高、誘導出的愈傷組織量大， 利于繼代培養。 羊角槭愈傷組織誘導最佳培養基為 WPM+0.3 mg·L－1NAA+0.5 mg·L－1KT+0.5 mg·L－16-BA，增殖最佳培養基為WPM+1.0 mg·L－16-BA+0.1 mg·L－1NAA，TDZ質量濃度的增加有利于羊角槭愈傷組織產生更多不定芽芽點，但誘導其愈傷組織分化出明顯不定芽的培養基配比還有待進一步研究。

表6 植物生長調節劑對愈傷組織增殖的影響Table 6 Effect of different plant hormones on callus proliferation

表7 植物生長調節劑對愈傷組織分化的影響Table 7 Effect of different plant hormones on callus differentiation

3.2 討論

4月取材的羊角槭外植體較之6月取材的外植體污染率低，且萌動早、生長速度快，出愈率高，更適宜于做初代培養。4月羊角槭處于葉芽萌動、展葉時期，此時植株長速快，新生幼嫩莖葉易于滅菌。6月取材的羊角槭外植體污染率較高，提高氯化汞滅菌時間也難以降低其污染率，且出愈率較低，可能因為其莖葉生長成熟，菌類等污染物侵入木質部等細胞組織，表面消毒難以達到消毒目的。組培所選外植體若為莖段，應選中度木質化的材料。不同樹種的采條最佳時間不同，不同的發生途徑對最佳外植體有一定的要求，因此，外植體選擇與發生途徑應同時考慮，將兩者有機結合起來［9］。

植物生長調節劑是植物組織培養中的關鍵物質。外植體的誘導和增殖不僅與植物生長調節劑的種類有關，還與其質量濃度及配比有關［10-11］。植物生長調節劑在植物不同的發育階段起決定性作用，其作用和效果也與外植體及愈傷組織本身內源激素的種類和質量濃度有重要關系。在植物組織培養過程中，適宜質量濃度的細胞分裂素6-BA可以有效地誘導芽的萌發與不定增殖，而適宜質量濃度的生長素可以促進莖的伸長［12］；2,4-D，KT，NAA等植物生長調節劑的配比使用有利于外植體愈傷組織的形成，且NAA質量濃度越高，形成的愈傷組織質地越好［13］。本研究結果表明：基本培養基類型，6-BA，NAA和KT等植物生長調節劑的質量濃度配比都能促進羊角槭愈傷組織誘導，但愈傷組織的誘導率、生長狀態存在一定差異。木本植物培養基（WPM）較之MS和1/2MS對愈傷組織誘導有更好的效果。在3種植物生長調節劑中，6-BA處理對羊角槭愈傷組織誘導的效果最明顯。愈傷組織在培養基上生長一段時間后，營養物枯竭，水分散失，并已經積累了一些可能對愈傷組織產生有害影響的代謝產物，此時需要將這些組織轉移到新的培養基上［14］。在愈傷組織增殖階段，愈傷組織的增殖倍數隨著NAA質量濃度的增加先上升后下降，NAA質量濃度為0.1 mg·L－1時，增殖倍數最大為2.40，說明NAA對愈傷組織增殖有促進作用，但NAA質量濃度過高會抑制愈傷組織的發生，NAA與6-BA的質量濃度配比為1∶10時增殖效果最佳。這與劉艷麗等［15］誘導盾葉薯蕷Dioscorea zingibernsis愈傷組織的結果相似。愈傷組織誘導不定芽分化的試驗中，植物生長調節劑的種類比例對分化的影響十分重要。本研究愈傷組織分化階段，添加TDZ有利于羊角槭愈傷組織產生更多不定芽芽點，說明TDZ是誘導不定芽分化的重要生長調節劑。這與白芨Bletilla striata［16］愈傷組織分化成不定芽的試驗結果相似。但本研究中愈傷組織只分化出芽點，并未分化出明顯不定芽，這可能是試驗方案中6-BA，NAA與TDZ的植物生長調節劑組合對羊角槭愈傷組織分化出芽的影響不明顯，促使其分化成芽的植物生長調節劑組合配比還有待進一步的研究。

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