黃芪莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

黃文靜，周 瑞，張嚴(yán)磊，王 楠，王二歡，田 鑫，2，孫建霞，2，唐志書，2

(1陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽 712083；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046；3陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安 710077)

黃芪具有雙向調(diào)節(jié)血糖、降血壓、抗心肌缺血和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用，應(yīng)用非常廣泛[1-4]。由于市場(chǎng)對(duì)黃芪的需求量逐年增加，其種植規(guī)模不斷擴(kuò)大[5-8]。黃芪莖葉中含有大量的黃酮類化合物，但在其主產(chǎn)區(qū)每年藥材采挖后地上莖葉往往丟棄，因此造成巨大的浪費(fèi)。本研究通過正交試驗(yàn)采用醇提法從黃芪莖葉中提取總黃酮，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性分析，以期為黃芪莖葉黃酮類物質(zhì)的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

本試驗(yàn)用黃芪為蒙古黃芪和膜莢黃芪混交種，其地上部分莖葉于9月上旬采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村黃芪種植基地。將割取的黃芪莖葉置于陰涼處晾干，粉碎機(jī)粉碎后裝于塑料袋中避光密封保存。

95%乙醇、無水乙醇、Tris、鄰苯三酚、水楊酸、鹽酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等化學(xué)試劑，陜西樂博生化試劑有限公司，均為分析純；DPPH、維生素C標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司。

高速粉碎機(jī)(廣州美的)、UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津)、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒)、電子天平(北京賽多利斯)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊)、RE-200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)、超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總黃酮含量測(cè)定 總黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[9]。以蘆丁作為對(duì)照品，于510 nm 處測(cè)定不同濃度蘆丁溶液的吸光值，以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=9.322 9X-0.003 9(R2=0.997 7)。

樣品總黃酮含量測(cè)定。稱取干燥黃芪莖葉粉末20g，用醇提法進(jìn)行提取。將醇提物烘干后加入50mL 無水乙醇溶解，以無水乙醇為空白，取1mL 醇溶液在510nm處測(cè)定光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

樣品提取率=0.002 5X×100%

(1)

1.2.2總黃酮提取工藝 黃芪莖葉總黃酮提取的工藝流程：樣品粉碎→過40目篩→稱重→加入乙醇→回流提取→抽濾→減壓濃縮→烘箱烘干→提取物浸膏。

參考其他植物黃酮提取文獻(xiàn)[10-13]，并根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

1.2.3總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定 黃芪莖葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定。參照徐秀泉等[14]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL，向其中加入0.2 mmol/L的DPPH 溶液1 mL，搖勻后黑暗處靜置30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光值，測(cè)定3次取平均值。

DPPH 清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ao×100

(2)

式(2)中，Ao為1mL DPPH溶液和1mL70%乙醇反應(yīng)后的吸光值、Ai為1mL DPPH溶液和1mL 樣品溶液反應(yīng)后的吸光值、Aj為1mL樣品溶液和1mL 的70%乙醇反應(yīng)后的吸光值。

黃芪莖葉總黃酮對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定。參照侯學(xué)敏等[15]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL(蒸餾水為對(duì)照)，向其中分別加入9mmol/mL的硫酸亞鐵溶液和水楊酸-乙醇溶液各1mL，再加入30%過氧化氫溶液1mL，35℃水浴35min后于510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。由于樣液本身具有吸光度，測(cè)其本底值時(shí)用蒸餾水代替過氧化氫。

羥基自由基清除率(%)=[Ao-(Ax-Axo)]/Ao×100

(3)

式(3)中，Axo是本底吸光度、Ax是加入樣品溶液后的吸光度、Ao是空白對(duì)照吸光度。

黃芪莖葉總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除效果的測(cè)定。參照陳晉明等[16]的方法，取不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的黃芪莖葉總黃酮和維生素C溶液1 mL(蒸餾水為對(duì)照)，向其中分別加入4.5 mL的Tris-HCl溶液(pH 8.2)和3.2 mL蒸餾水，混勻后35℃預(yù)熱10 min，然后立即加入預(yù)熱的3 mmol/L 鄰苯三酚0.5 mL，室溫下反應(yīng)5min后向其中加入2滴8mol/LHCl終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)320 nm 處測(cè)吸光度。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(1-Ao/Ax)×100

(4)

式(4)中，Ao為對(duì)照的吸光度、Ax為加入樣品后的吸光度。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用Excel處理作圖，正交試驗(yàn)分析及方差計(jì)算使用正交設(shè)計(jì)Ⅱ?qū)I(yè)版進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪莖葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)分析

總黃酮的提取率在1.14%～3.825%之間，根據(jù)極差分析可知，總黃酮提取工藝中各因素對(duì)提取率的影響程度為D>A>B>C，最優(yōu)組合為A3B1C1D3，即乙醇濃度為90%、料液比為1∶10、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為1.5 h(表2)。由表3可知，乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響顯著，提取溫度與料液比對(duì)結(jié)果影響不顯著。

表2 總黃酮提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：*對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)，下同

綜合以上考慮，選擇黃芪莖葉總黃酮的提取條件為A3B1C1D3，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，總黃酮提取率為3.82%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，證明該結(jié)果合理可靠。

2.2 黃芪莖葉總黃酮抗氧化活性分析

2.2.1DPPH自由基清除能力 如圖1所示，隨著黃芪莖葉總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐漸提高，在其濃度為0.01mg/mL時(shí)，DPPH的清除率僅為57.28%，當(dāng)其濃度上升至0.4mg/mL時(shí)，DPPH清除率高達(dá)88.60%。以維生素C為參照，當(dāng)其質(zhì)量濃度均為0.4mg/mL時(shí)，黃芪莖葉總黃酮清除DPPH自由基的能力是維生素C的96.09%，說明其具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖1 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率

2.2.2羥基自由基清除能力 由圖2可知，維生素C和黃芪莖葉總黃酮清除羥基自由基的能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)黃芪莖葉總黃酮質(zhì)量濃度由0.01mg/mL升高10倍后，其羥基自由基的清除率從33.26%急劇上升至78.42%；當(dāng)其和維生素C的質(zhì)量濃度均為0.4mg/mL時(shí)，其清除羥基自由基的能力是維生素C的89.75%，可知黃芪莖葉總黃酮具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對(duì)羥基自由基的清除率

2.2.3超氧陰離子自由基清除能力 由圖3可知，黃芪莖葉總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在0.01～0.4 mg/mL內(nèi)，清除率由33.27%上升至85.12%。以維生素C為參照，在黃酮質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基清除能力是維生素C的77.27% 。

圖3 不同質(zhì)量濃度總黃酮和維生素C對(duì)超氧 陰離子自由基的清除率

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)黃芪莖葉進(jìn)行醇提，確定了黃芪莖葉總黃酮提取的最佳工藝，即乙醇濃度為90%、料液比為1∶10、在60℃下提取1.5 h，總黃酮提取率為3.82%。此工藝條件下，90%濃度的乙醇擁有更高的有機(jī)相，在60℃下進(jìn)行提取黃酮類化合物不會(huì)因高溫破壞結(jié)構(gòu)而分解，與此同時(shí)，較低的料液比也可緩解因提取時(shí)間變長(zhǎng)而引起的成本上升，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，安全可靠。通過對(duì)黃芪莖葉總黃酮進(jìn)行體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，其擁有較高的DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力，以維生素C為對(duì)照，在0.4mg/mL濃度下其清除3種自由基的能力分別是維生素C的96.09%、89.75%、77.27%。

本研究顯示，通過簡(jiǎn)單的醇提加工便可得到具有很好抗氧化效果的黃芪莖葉總黃酮，如將其繼續(xù)開發(fā)為保健產(chǎn)品或食品添加劑，不僅可減少資源的浪費(fèi)，還可延伸黃芪產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)鏈，具有重要的生態(tài)意義和實(shí)踐意義。◇