輸尿管不全梗阻大鼠輸尿管平滑肌損傷及肌球蛋白表達變化的臨床意義

安文亞，趙澤駒，羅逸航，辜浩，吳宇波

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000)

輸尿管不全梗阻臨床較為多見，多與結石有關。研究發現，輸尿管不全梗阻時間越長對機體的損害越重，且輸尿管損害先于腎損害[1]。2016年11月～2017年9月,本研究觀察了輸尿管不全梗阻大鼠梗阻不同時間輸尿管形態結構及平滑肌細胞肌球蛋白表達變化，旨在為臨床判斷輸尿管不全梗阻患者的輸尿管功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康10～12周齡SD大鼠120只，雌雄各半，體質量250～300 g，第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0005。飼養于遵義醫學院中心實驗室，雌雄分開，普通標準飼料喂養，自由飲水，室溫18～22 ℃，相對濕度45%～65%。試劑與儀器：肌球蛋白兔抗鼠一抗(SA1022)、抗體稀釋液(AR10161)、即用型正常山羊血清(AR0009)，武漢博士德生物工程有限公司；肌球蛋白重鏈mRAN，南京金斯瑞生物科技有限公司。免疫組化檢測試劑盒(GK500705)，上海基因科技股份有限公司；TransZol Up、逆轉錄與擴增試劑盒，北京全式金生物技術有限公司。CKX31普通光學倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MyiQ2定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 輸尿管不全梗阻模型制作 所有大鼠適應性飼養3周，隨機分為對照組30只、假手術組45只和模型組45只。模型組參照腰大肌隧道包埋法[2,3]制作輸尿管不全梗阻模型：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，下腹正中切口，腹腔探查，于膀胱附近分離、游離右側輸尿管下段約2.0 cm，于右側輸尿管后方腰大肌處鈍性分離出一條長約2.0 cm、深約0.5 cm的裂隙，將游離的輸尿管下段置于裂隙底部；腹腔放少量青霉素，1號絲線間斷縫合2針關閉裂隙，縫合切口。假手術組分離裂隙后不放置游離的輸尿管，其余操作同模型組。對照組不制作輸尿管不全梗阻模型，正常飼養。

1.3 相關指標觀察 造模1、2、3周隨機選擇對照組10只、假手術組及模型組各15只處死。對照組及假手術組探查腹腔，分離并切取右側腎及輸尿管；模型組找到右側輸尿管下段包埋處線結，分離顯露輸尿管、腎臟，貼膀胱壁剪斷輸尿管，擠壓腎臟見尿液從近側斷端流出，切除右側腎臟及輸尿管。觀察三組以下指標。①輸尿管、腎臟形態及右側輸尿管直徑：肉眼觀察輸尿管及腎臟形態，測量右側輸尿管三個橫斷面直徑(游標卡尺0.05 mm)，結果取平均值。②輸尿管平滑肌細胞形態：取輸尿管用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，采用HE染色觀察不同時段輸尿管平滑肌組織細胞結構變化。③輸尿管平滑肌肌球蛋白表達：采用免疫組化SP法檢測。取三組輸尿管平滑肌組織切片，參照試劑盒說明書進行輸尿管平滑肌肌球蛋白表達檢測。以PBS代替一抗作為陰性對照。以平滑肌細胞胞質內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。采用Leica Qwin和Image-proplus6.0圖像處理系統測量各組平均光密度(IOD)。④輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA表達：采用qRT-PCR法檢測。采用TRIzol法提取三組各時間點輸尿管平滑肌肌球蛋白總RNA，以RNA為模板，按照EasyScript逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，用TransStart試劑盒進行熒光定量PCR。基因擴增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。引物序列：肌球蛋白重鏈上游引物5′-GGCAAGAAGCAGATCCAGA-3′，下游引物5′-CTTCAACATTGCGCTTCTGT-3′；β-actin上游引物5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物5′-GGGGTGTTGAAGGTCTVAAA-3′。PCR反應體系：2×TransStart Tip Green qPCR Supermix 5.0 μL，10 mol/L上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O補足總體積至10 μL；每孔加入10 μL反應體系，每個樣本設3個復孔。PCR反應條件：94.0 ℃變性30 s，94.0 ℃退火5 s，60.0 ℃延伸30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 三組輸尿管及腎臟形態比較 造模1、2、3周對照組與假手術組腎及輸尿管形態比較無明顯差異。與對照組與假手術組相比，模型組梗阻1周時近端輸尿管稍增粗；腎臟體積略有增大、張力稍高；2周時輸尿管增粗明顯，壁厚；腎臟體積增大、包膜張力高、皮質變薄、腎盂擴張；3周時梗阻近端輸尿管顯著增粗，管壁明顯變薄；腎臟體積增大、外形不規則，腎實質菲薄，腎盂、腎盞變形、擴大。模型組造模1、2、3周右側輸尿管直徑逐漸增大，且均較對照組、假手術組增加(P均<0.01)；對照組與假手術組輸尿管直徑比較差異無統計學意義(P>均0.05)。見表1。

表1 三組右側輸尿管直徑比較

注：與對照組及假手術組比較，△P<0.01。

2.2 三組輸尿管平滑肌組織細胞形態比較 HE染色結果顯示，對照組、假手術組輸尿管平滑肌細胞各時段變化無明顯差異，細胞層次清晰、排列整齊、胞質及胞核無明顯異常。模型組1、2周梗阻近端輸尿管平滑肌細胞出現代償肥大增生，胞核增大，細胞排列部分紊亂，梗阻時間越長，上述表現越明顯；但模型組3周時出現梗阻近端輸尿管平滑肌細胞體積變小，細胞核萎縮，部分平滑肌細胞被增生的纖維結蹄組織替代，與模型組1、2周形成明顯差別。

2.3 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達比較 造模1、2周，模型組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達量均高于對照組和假手術組，術后3周均低于對照組和假手術組，組間比較P均<0.01；造模1、2、3周,模型組肌球蛋白表達各時間點兩兩比較P均<0.01；對照組與假手術組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白表達比較

注：與對照組及假手術組比較，*P<0.01；與模型組造模1周比較，△P<0.01;與模型組造模2周比較，#P<0.01。

2.4 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA表達比較 造模1、2周,模型組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA相對表達量均高于對照組和假手術組，造模3周均低于對照組和假手術組，組間比較P均<0.01；造模1、2、3周，模型組肌球蛋白重鏈mRNA相對表達量各時間點兩兩比較P均<0.01；對照組與假手術組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 三組輸尿管平滑肌肌球蛋白重鏈mRNA相對表達量比較

注：與對照組及假手術組比較，*P<0.01；與模型組造模1周比較，△P<0.01;與模型組造模2周比較，#P<0.01。

3 討論

輸尿管是肌性、管狀、空腔器官，依賴平滑肌節律性收縮協助排尿。發生梗阻后尿液滯留，梗阻近端壓力升高，輸尿管、腎盂平滑肌收縮力反射性增加，以排出更多尿液緩解壓力，保護腎臟泌尿功能[4]。輸尿管完全梗阻時，隨時間延長尿液潴留增加，近端積水及壓力快速升高，腎盂壓>10 mmHg時出現腎實質返流，腎血流分布改變，髓質流量增加，泌尿功能逐漸下降甚至停止，此時輸尿管、腎盂維持高壓，功能停止，不可逆性損害持續，出現萎縮性改變[5,6]。輸尿管不全梗阻時，因始終有部分尿液排出，梗阻近端壓力有一定程度緩解，輸尿管、腎盂平滑肌收縮、擴張以期排出更多尿液，呈現由代償到失代償的轉化過程。隨梗阻時間延長，輸尿管擴張、積水逐漸增加，波及腎臟，導致腎積水、體積增大、實質萎縮，最終使輸尿管過度擴張增粗類似于“腸管”，巨大腎積水形成，輸尿管管壁及腎實質均菲薄，腎單位耗竭。梗阻解除后輸尿管及腎功能能否恢復與不全梗阻時間有關[7]。部分患者腎功能恢復，但近端輸尿管過度擴張、積水，腎臟代償性積水增大、實質萎縮，輸尿管仍擴張、積水、收縮乏力，極易因再發小結石、尿鹽結晶、脫落壞死組織或感染性膿苔等形成再梗阻，甚至誘發腎功能衰竭[8]。

在輸尿管不全梗阻過程中，輸尿管病理損害先于腎臟損害出現，且輸尿管平滑肌最先受累[9]。梗阻早期輸尿管即可出現肌細胞內離子穩態破壞、鈣超載、線粒體和肌球蛋白等超微結構異常[10～12]；平滑肌細胞內鈣離子平衡失調，導致鈣離子分布紊亂，出現鈣離子超載，通過影響線粒體膜通透性及鈣調蛋白活性導致平滑肌細胞受損及凋亡[13]。平滑肌肌球蛋白由兩條輕鏈和兩條重鏈構成六聚體，兩條重鏈通過C端的α-螺旋結構相互作用形成二聚體，構成肌球蛋白的主體[14]。肌球蛋白可分為頭部、頸部和尾部三個部分。頭部有與肌動蛋白結合部位及與ATP結合部位，與其長軸成角，因此也稱為橫橋；頸部是α-螺旋結構，可與兩個輕鏈相結合，起著調整頭部活動性的作用[15]；頸部之后是α-螺旋的尾部，末端是非螺旋化的較短的結構域。每個肌球蛋白分子含有兩個完全相同的頭部，都具有Ca2+-ATP酶活性，其活性直接影響肌纖維的收縮力量及速度。肌球蛋白的變化包括信使mRNA相對表達量、肌球蛋白表達量、肌球蛋白構象以及肌球蛋白活性改變等形式[16]。肌球蛋白對輸尿管病理損害最為敏感，輸尿管梗阻期間肌球蛋白的變化規律可反映不同時段輸尿管平滑肌功能狀態，對輸尿管及腎臟損傷有預警作用。

本研究結果顯示，模型組隨梗阻時間延長，近端輸尿管逐漸擴張，造模2、3周時腎盂擴張積水、腎臟體積增大，提示輸尿管不全梗阻2、3周時已出現腎臟損害。形態學觀察發現，梗阻2周時輸尿管平滑肌肌層增厚，細胞代償性增生肥大，細胞核變大，呈長梭型；但梗阻3周時管壁平滑肌纖維卻明顯減少，肌層變薄、細胞萎縮、核小而圓、細胞排列紊亂、纖維增生明顯，與梗阻2周時比較差異顯著。梗阻1、2周時肌球蛋白表達量逐漸增加，但3周時則顯著降低，甚至低于對照組與假手術組；肌球蛋白重鏈mRNA相對表達量也呈類似變化。說明不全梗阻過程中，平滑肌細胞分子結構變化與形態結構改變相適應。上述變化提示梗阻3周時平滑肌細胞出現了不可逆性損傷[17]。輸尿管梗阻后平滑肌細胞損害或凋亡增加使肌球蛋白重鏈mRNA表達量發生變化，進而影響肌球蛋白表達，最終導致其功能改變。白志明等[18]研究證實，肌球蛋白表達與其功能狀態密切相關。本研究模型組梗阻2～3周期間肌球蛋白表達變化說明此段時間輸尿管功能是代償到失代償的轉化，梗阻2周內解除梗阻可阻止輸尿管繼續損害。

綜上所述，輸尿管不全梗阻時間越長、平滑肌損傷越重；梗阻超過2周將出現輸尿管功能不可逆性損傷。