厄貝沙坦對糖尿病大鼠腎臟FN、DKK1及β-catenin表達的影響

陳碧珊，吳紅衛，李艷，張濱，陳吉生

(廣東藥科大學附屬第一醫院，廣州510080)

糖尿病腎病是糖尿病最常見且難治的微血管并發癥之一，常發展為終末期腎病，是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。糖尿病腎病主要表現為腎功能減退及蛋白尿，腎小球細胞外基質(ECM)產生過多及降解不足，導致過度沉積，是糖尿病腎病最顯著的病理特征之一[2]。纖維連接蛋白(FN)是ECM的重要成分，也是糖尿病患者腎臟器質性改變的重要早期標志物。Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)作為一條與腎腫瘤及慢性腎病等腎臟疾病發生、發展有關的保守信號通路，參與系膜細胞凋亡及蛋白尿的產生[3]。Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin信號通路的拮抗劑，能夠介導高糖條件下系膜細胞β-catenin的不穩定性及致纖維化因子FN表達[4]。血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(AT1Ra)厄貝沙坦是治療糖尿病腎病的藥物之一，具有減少蛋白尿、延緩糖尿病腎病進展的作用[5]，但其具體機制尚未明確。2017年1月～2018年3月，本研究觀察了厄貝沙坦干預對糖尿病大鼠腎組織FN、DKK1及β-catenin表達的影響，探討厄貝沙坦抑制糖尿病腎損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康雄性SD大鼠32只，體質量200～220 g。厄貝沙坦(安博維，150 mg/片，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma)；兔抗大鼠 FN多抗(博士德生物工程有限公司)，兔抗DKK1多抗、小鼠抗 β-catenin單抗(美國 Santa Cruz公司)，FN、DKK1、β-catenin引物、逆轉錄及擴增試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，小鼠超敏、兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB 液，BCA 蛋白濃度測定及提取總蛋白的試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)。

1.2 糖尿病腎病模型建立及厄貝沙坦干預 32只SD大鼠適應性喂養1周，按隨機數字表法選取10只設為正常組，腹腔注射造模用等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，尾靜脈取血測血糖，使血糖穩定在4.7～8.3 mmol/L。其余22只用于造模，給予無菌檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L，pH 4.5)溶解的STZ(終濃度 0. 4%)60 mg/kg左下腹腔注射，72 h后尾靜脈取血檢測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L確定為建模成功。結果顯示，厄貝沙坦組、模型組、正常組空腹血糖分別為(24.1±2.7)、(26.1±3.0)、(9.6±1.5)mmol/L，厄貝沙坦組、模型組空腹血糖均高于正常組(P均<0.05)。其中20只造模成功，隨機分為模型組和厄貝沙坦組，每組10只。厄貝沙坦組給予厄貝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃，每天上午9時1次；正常組和模型組在同一時間給予等量雙蒸水灌胃。連續每天灌胃給藥12周。

1.3 相關指標觀察 各組灌胃干預結束后處死。處死前1天用代謝籠收集24 h尿液，-80 ℃冰箱保存。處死前12 h禁食，測量體質量。10%水合氯醛麻醉后于頸主動脈取血2 mL；切取腎臟清洗后吸干水分后稱取腎質量，計算腎質量/體質量。將腎臟置冰臺上去掉被膜，左腎用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片；右腎置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 血尿素氮(BUN)、24 h尿白蛋白/尿肌酐(UACR) 取頸主動脈血，采用ROCHE MODU-LAR全自動生化儀檢測BUN；取24 h尿液，采用ROCHE MODU-LAR全自動生化儀檢測24 h尿白蛋白、尿肌酐，并計算其比值，即為UACR。

1.3.2 腎組織FN、DKK1及β-catenin蛋白表達 取左腎組織切片，免疫組化法檢測FN、DKK1及β-catenin蛋白表達。以PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片在400倍光鏡下隨機選取10個腎小球視野，以Olympus公司圖像采集系統與北航醫學圖像分析管理系統進行半定量分析，分別計算FN、DKK1及β-catenin染色陽性區域面積/整個腎小球面積的比值，并分別以此表示FN、DKK1及β-catenin蛋白表達。

1.3.3 腎組織FN、DKK1、β-catenin mRNA表達 采用實時熒光定量 PCR法檢測FN、DKK1、β-catenin mRNA表達。取右腎組織0.1 g使用TRIzol試劑提取腎組織RNA，測定其純度與濃度。符合要求后根據逆轉錄試劑盒說明加入反轉錄cDNA。擴增反應系統采用SYBR Green，每個樣品采取3孔平行反應，反應管中分別加入SYBR PremixEx Taq(2×)25 μL，上下游引物各2 μL，ROX Ref-erence Dye(50×)1 μL，cDNA 溶液4 μL，dH2O 16 μL，配制成50 μL反應體系。上機后95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。使用雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算FN、DKK1、β-catenin mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 三組腎質量/體質量比較 模型組、厄貝沙坦組、正常組腎質量/體質量分別為(4.7±0.6)%、(3.8±0.5)%、(3.2±0.4)%，三組間比較P均<0.05。

2.2 三組血BUN、UACR比較 模型組、厄貝沙坦組血BUN及UACR均高于正常組，厄貝沙坦組均低于模型組，組間比較P均<0.05。見表1。

表1 三組血BUN、UACR比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 三組腎組織FN、DKK1、β-catenin蛋白表達比較 模型組、厄貝沙坦腎組織FN、DKK1蛋白表達均高于正常組，β-catenin蛋白表達均降低正常組(P均<0.05)；厄貝沙坦組腎組織FN、DKK1蛋白表達均低于模型組，β-catenin蛋白表達均高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 三組腎組織FN、DKK1、β-catenin蛋白比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 三組腎組織FN、DKK1、β-catenin mRNA表達比較 模型組、厄貝沙坦組腎組織FN、DKK1 mRNA相對表達量均高于正常組，厄貝沙坦組均低于模型組，組間比較P均<0.05；三組腎組織β-catenin mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

2.5 糖尿病大鼠腎組織DKK1 mRNA表達與UACR、FN mRNA表達的關系 糖尿病大鼠腎組織DKK1 mRNA表達與UACR呈正相關(r=0.796，P<0.05)，與FN mRNA表達呈正相關(r=0.751，P<0.05)。

表3 三組腎組織FN、DKK1、β-catenin mRNA相對表達量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

FN主要由系膜細胞產生，作為ECM中的重要大分子糖蛋白之一，可與ECM各類成分結合，促使ECM其他成分逐漸沉積[6]。FN表達異常增高反映了ECM的過度累積，是判斷糖尿病腎病腎小球硬化與腎間質纖維化的指標[7]。Wnt/β-catenin信號通路具有調控系膜細胞功能的重要作用，介導了糖尿病腎病動物模型的腎臟纖維化[8]。其經典途徑可概括為：β-catenin降解復合體解離-β-catenin積累入核-與TCF/LEF相互作用-激活cyclinD1、c-myc等靶基因轉錄[9]。人DKK1基因位于10號染色體上，不同細胞中提取到的DKK1基因的分子質量不同，多數介于35～45 kU。DKK1是Wnt信號通路的重要調節因子，能夠抑制Wnt信號向細胞內傳遞[10]，DKK1通過Wnt/β-catenin經典信號傳導途徑以及Wnt非經典信號傳導途徑在多種腫瘤的發生發展中發揮重要作用[11]。β-catenin是一種多功能蛋白，通過與細胞骨架的相互作用，協助細胞對細胞外的信號作出反應，在細胞核內充當轉錄因子，啟動促使細胞分裂的基因[12]。

厄貝沙坦為AngⅡ受體抑制劑，能抑制AngⅠ轉化為AngⅡ，特異性地拮抗血管緊張素轉換酶1(AT1)受體，其對AT1受體的拮抗作用大于AT2受體的8 500倍，通過選擇性阻斷AngⅡ與AT1受體結合，抑制血管收縮和醛固酮釋放，發揮降壓作用[13]。糖尿病腎病患者體內腎素-血管緊張素系統(RAS)過度激活，AngⅡ分泌顯著增加，厄貝沙坦作為AngⅡ選擇性的AT1受體拮抗藥，可阻斷由AT1受體介導的AngⅡ活性，延緩腎臟病變，發揮保護腎臟的作用[14,15]。

本研究結果顯示，糖尿病大鼠造模成功12周出現腎質量/體質量、BUN及UACR增加，提示糖尿病大鼠出現腎臟損傷。免疫組化結果顯示，模型組FN與DKK1表達均高于正常組，厄貝沙坦治療后FN與DKK1表達下降，實時熒光定量PCR結果與上述免疫組化結果一致，相關分析提示模型組DKK1 mRNA表達與 FN mRNA表達呈正相關性。提示FN與DKK1可能參與了糖尿病大鼠腎臟 ECM的沉積過程，二者共同參與糖尿病腎病的發生；厄貝沙坦可能通過抑制FN、DKK1表達延緩或抑制糖尿病腎病的發生及進展。本研究結果顯示，模型組和厄貝沙坦組β-catenin 蛋白表達顯著低于正常組，兩組β-catenin mRNA表達與正常組比較差異無明顯統計學意義。表明糖尿病狀態下β-catenin 蛋白水平降低可能是由于其降解速度增加所致，并非由β-catenin mRNA翻譯后蛋白增加引起。β-catenin 蛋白降解增加的原因可能與DKK1表達增加、抑制 Wnt信號途徑有關。經厄貝沙坦治療后，DKK1表達被抑制，β-catenin 蛋白水平有所提升，進而延緩腎臟病變的發展。

綜上所述，厄貝沙坦對糖尿病腎病大鼠腎損傷有抑制作用，其機制可能為抑制FN、DKK1表達，促進β-catenin表達。