麥冬皂苷D預處理對PM2.5介導肺泡Ⅱ型上皮細胞炎性損傷的抑制作用及其機制

王瑩，宋磊，孫立燕，張珍珍，丁會

(吉林大學白求恩第一醫院，吉林長春130021)

大氣細顆粒物(PM2.5)即空氣動力學直徑≤2.5 μm的細顆粒物，是工業化飛速發展的毒性產物。正常情況下，短期低濃度PM2.5吸入可被氣道表面的黏液吸附，并通過纖毛擺動排出；而長期高濃度PM2.5吸入可損傷氣道上皮，降低其清除能力，導致PM2.5堆積并停留在呼吸道；且部分PM2.5可穿透氣-血屏障入循環系統，引起和加重肺、心血管乃至整個機體的損傷[1]。研究證實，吸入PM2.5濃度與呼吸道疾病發病率呈正相關[2,3]，而NF-κB誘導炎癥介質表達是PM2.5引起炎癥反應的主要機制[4]。麥冬皂苷D是從麥冬中提取的一種甾體皂苷類化合物[5,6]。王亮等[7]發現，麥冬皂苷D可通過抑制NF-κB信號通路對小腸上皮細胞產生抗炎作用，但其是否可以減輕PM2.5誘導的氣道炎癥反應及其作用機制尚不清楚。為此，我們于2017年12月～2018年4月進行了如下研究。

1 材料

細胞：肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12購于中國科學院上海細胞所。主要試劑：麥冬皂苷D(含量質量分數≥98%，中國Biotoppe公司)，PM2.5、DMEM培養基(美國Corning公司)，FBS、PBS、雙抗、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒(中國Transgen公司)、二甲基亞砜、細胞核蛋白提取試劑盒(美國Sigma公司)，小鼠細胞上清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 ELISA 試劑盒(中國Bpro公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒(美國Thermo公司)，NF-κB p65一抗、GAPDH、HRP-goat anti-rabbit IgG、FITC Goat anti-Rabbit(美國ABclonal公司)。

2 方法與結果

2.1 PM2.5懸濁液及麥冬皂苷D溶液配制 ①PM2.5懸濁液：使用顆粒采樣器采集大氣PM2.5于玻璃纖維濾膜(孔徑2.5 μm)上，濾膜剪裁成直徑約1 cm的小片濾膜，浸泡在無菌蒸餾水中。水浴超聲儀中超聲震蕩 60 min，得到含有PM2.5的懸濁液，無菌紗布過濾，真空冷凝法干燥，再用無菌PBS配置成PM2.5懸濁液。應用前超聲震蕩滅菌30 min，使顆粒物充分混勻。②麥冬皂苷D溶液：將麥冬皂苷D用DMSO配成質量濃度為10 μmol/L的原液，實驗時再用DMEM培養基稀釋至所需濃度(DMSO濃度小于總體積的0.01%)。

2.2 麥冬皂苷D安全用藥范圍觀察 采用CCK-8法。將MLE-12細胞接種于含10% FBS的DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。取對數生長期的MLE-12細胞，以5×103個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，恒溫培養箱中培養24 h。每孔中加入麥冬皂苷D，使其終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L。以不含藥物的細胞為陰性對照組，以含DMSO培養基的細胞為空白對照組，分別加入含0.01% DMSO的細胞培養液，每組設4個復孔。37 ℃孵育24 h，加入CCK-8溶液10 μL/孔。作用2 h后使用酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。細胞活性=(A藥物組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)×100%。結果顯示，加入終濃度分別0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L麥冬皂苷D的MLE-12細胞活性分別為(100.37±1.02)%、(101.29±3.04)%、(100.05±2.53)%、(96.65±2.54)%、(96.87±2.80)%、(95.09±1.53)%、(88.53±1.95)%、(77.18±2.95)%；麥冬皂苷D濃度≤80 μmol/L時對MLE-12細胞活性無明顯影響(P均>0.05)，麥冬皂苷D濃度≥160 μmol/L時MLE-12細胞活性明顯下降(P均<0.01)。選取10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D進行后續實驗。

2.3 麥冬皂苷D預處理對PM2.5介導的MLE-12細胞炎性因子及NF-κB p65表達影響的觀察

2.3.1 麥冬皂苷D預處理 取對數生長期MLE-12細胞，調整細胞密度為3×105個/mL，接種于6 孔板，每孔3 mL。將MLE-12細胞隨機分為空白對照組、PM2.5組及麥冬皂苷D組，麥冬皂苷D組分別加入濃度為10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D預處理1 h。預處理后麥冬皂苷D組及PM2.5組分別加入PM2.5混懸液，并調整其終濃度為80 μg/mL，作用24 h；空白對照組不作任何處理。

2.3.2 細胞培養基上清炎性因子表達檢測 采用ELISA法。干預24 h 收集各組細胞培養基上清，標準品稀釋后加樣、溫育、洗滌、酶標顯色，每組設4個復孔，同時設置空白孔消除背景差異。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組培養基上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達量。加終止液后10 min內檢測各組450 nm波長處的光密度(OD)值，根據樣品的OD值由標準曲線公式計算相應濃度。結果顯示：PM2.5組培養基上清IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達均明顯高于空白對照組(P均<0.01)，加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達均低于PM2.5組(P均<0.01)。加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養基上清IL-8、TNF-α表達均高于對照組，加入10、20、40 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養基上清IL-1β、IL-6表達均高于對照組(P<0.05或<0.01)。加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養基上清IL-1β、IL-6表達與對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組培養基上清炎性因子表達比較

注：與PM2.5組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.3.3 細胞核及細胞質NF-κB p65蛋白表達檢測 采用Western blotting法。干預24 h收集各組細胞，按細胞核蛋白提取試劑盒說明加入裂解液，依次提取細胞質蛋白和細胞核蛋白。BCA法進行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸變性10 min，經SDS-PAGE、轉膜、封閉；加入NF-κB p65兔源一抗(稀釋倍數為1∶1 000)，4 ℃過夜，PBST洗3次后加入HRP標記的抗兔二抗(稀釋倍數為1∶5 000)，室溫孵育1 h，PBST洗3次。加入ECL顯影液顯色，化學發光凝膠成像系統下顯影成像，Image J軟件對目的條帶進行灰度掃描。細胞核NF-κB p65蛋白以lamin B為內參，細胞質NF-κB p65蛋白以GAPDH為內參；以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。結果顯示,PM2.5組細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量高于對照組，細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.01)；加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量均高于PM2.5組，加入20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量均低于PM2.5組(P均<0.01)。見表2。

3 討論

研究發現，麥冬皂苷D在人肺癌細胞中可通過調節NF-κB、PI3K/AKT及AP-1等多種信號通路，抑制腫瘤細胞增殖及化療增敏性，發揮抗腫瘤作用[8]；通過調節Wnt/β-catenin信號通路，抑制氧化應激改善糖尿病患者鈦合金植入物的成骨融合[9]；還可通過下調CYP2J2/EETs系統相關因子表達發揮抗炎作用[10]。近期研究發現，麥冬皂苷D可通過上調細胞色素450表氧化酶基因表達而抑制體內炎癥反應，從而減輕大鼠心肌肥厚[11]。本研究結果顯示，麥冬皂苷D干預濃度≤80 μmol/L時對MLE-12細胞活性無明顯影響，≥160 μmol/L時則可導致細胞活性明顯下降；表明高濃度麥冬皂苷D對MLE-12細胞生長具有明顯抑制作用，其安全用藥范圍為≤80 μmol/L，此時細胞毒性較小。

表2 各組細胞核及細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量比較

注：與PM2.5組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，△P<0.01。

PM2.5能刺激肺上皮細胞及免疫細胞，促進局部炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1等釋放，啟動炎癥級聯反應及放大肺組織局部炎癥反應[12～14]。本研究結果顯示，PM2.5組培養基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達均高于對照組，說明PM2.5可導致MLE-12細胞發生炎性損傷；加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組培養基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達均低于PM2.5組，說明80 μmol/L麥冬皂苷D可明顯減輕PM2.5引起的MLE-12細胞炎性損傷。本研究加入不同濃度麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-8、TNF-α表達均高于對照組，加入10、20、40 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-1β、IL-6表達均高于對照組，而加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組IL-1β、IL-6表達與對照組比較差異均無統計學意義；說明安全范圍內高濃度麥冬皂苷D可減輕PM2.5引起的MLE-12細胞炎性損傷，以80 μmol/L麥冬皂苷D的作用效果最好。

NF-κB是一種廣泛表達的炎癥調節轉錄因子，其中NF-κB p65是NF-κB的活性形式，在某些有效刺激的作用下，激活的NF-κB會迅速由細胞質進入細胞核，結合至TNF-α、IL-1β、IL-6等多種促炎基因啟動子區的作用位點，從而激活上述基因的轉錄翻譯，導致多種炎癥因子的表達和釋放增加，促進炎癥的發生；同時這些炎性因子反過來又可以激活NF-κB，形成惡性循環，導致廣泛而持續的炎癥損傷[15]。細胞內NF-κB p65總量處于恒定水平，細胞核內活性NF-κB p65蛋白表達升高必然伴隨細胞質內表達降低，也伴隨NF-κB相關信號通路的啟動激活。本研究結果顯示，PM2.5組細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量明顯高于對照組，而細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量低于對照組，說明PM2.5介導的MLE-12細胞發生炎性損傷可能與NF-κB入核及其相關信號通路激活有關。本研究中加入10、20、40、80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細胞質NF-κB p65蛋白相對表達量均高于PM2.5組，并呈劑量依賴性升高，而其細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量則呈相反趨勢；加入80 μmol/L麥冬皂苷D的麥冬皂苷D組細胞核NF-κB p65蛋白相對表達量明顯低于PM2.5組并與對照組無統計學差異；說明麥冬皂苷D可抑制PM2.5介導的MLE-12細胞NF-κB入核及其相關信號通路激活，以80 μmol/L濃度時的效果最明顯。

綜上所述，麥冬皂苷D預處理可減輕PM2.5引起的MLE-12細胞炎性損傷，80 μmol/L濃度時作用最明顯且細胞毒性較小；其機制可能與抑制NF-κB p65入核及其相關信號通路激活有關。