長鏈非編碼RNA MALAT1在骨肉瘤細胞中的表達變化及其對細胞侵襲能力的影響

王濤，劉一澤，馮健洲，周禹伯，申德偉，王勇

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽 110024)

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，好發(fā)于長骨干骺端[1,2]。骨肉瘤患者的5年生存率為30%～75%，多數(shù)患者的最終死因為腫瘤復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[3,4]。長鏈非編碼RNA (lncRNA)是真核細胞中一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA，其在X染色體沉默、 基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)冗^程中均發(fā)揮重要作用[5,6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在骨肉瘤等多種腫瘤組織中異常表達，并與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關[7]。lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄物1(lncRNA MALAT1)在多種腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因作用，但是目前關于其在骨肉瘤中的作用鮮見報道。為此，我們于2017年9月～2018年3月進行了如下研究。

1 材料

細胞：人骨肉瘤細胞株MG-63(簡稱骨肉瘤細胞)、人成骨細胞系hFOB1.19(簡稱成骨細胞)均購自中科院上海細胞庫(將骨肉瘤細胞置于DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；成骨細胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，34 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以上兩種培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，待兩種細胞融合率達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代)。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，SYBR Master Mixture購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，anti-GAPDH一抗、anti-ROCK1一抗及HRP標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司，Transwell小室購自美國Corning公司。主要質(zhì)粒：MALAT1沉默質(zhì)粒MALAT1-siRNA及其對照質(zhì)粒con-siRNA、ROCK1過表達載體質(zhì)粒oe-ROCK1及其對照質(zhì)粒pcDNA均由廣州銳博公司設計合成。

2 方法與結(jié)果

2.1 骨肉瘤細胞與成骨細胞lncRNA MALAT1表達檢測 采用qRT-PCR法。取生長狀況良好的骨肉瘤細胞與成骨細胞，加入細胞裂解液進行裂解，參照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，按照Invitrogen試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒在熒光定量儀上進行PCR反應。lncRNA MALAT1上游引物：5′-GCGACGAGTTGTGCTGCTATCT-3′，下游引物：5′- ACACTGCTCTGGGTCTGCTTTT-3′； 以β-actin為內(nèi)參，β-actin上游引物：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。 PCR反應條件： 95 ℃預變性15 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。以lncRNA MALAT1與β-actin條帶灰度值的比值計算lncRNA MALAT1相對表達量。結(jié)果顯示，骨肉瘤細胞與成骨細胞lncRNA MALAT1相對表達量分別為6.94±0.63、1.43±0.24，二者比較P<0.01。

2.2 lncRNA MALAT1沉默對骨肉瘤細胞侵襲能力及ROCK1蛋白表達的影響

2.2.1 骨肉瘤細胞MALAT1沉默模型建立 取生長狀況良好的骨肉瘤細胞，胰酶消化后接種于6孔板中，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔，隨機分為MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組，培養(yǎng)24 h后分別參照LipofectamineTM3000說明書轉(zhuǎn)染MALAT1-siRNA質(zhì)粒及con-siRNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h采用qRT-PCR法(具體步驟參照2.1)檢測兩組lncRNA MALAT1表達。結(jié)果顯示MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組lncRNA MALAT1相對表達量分別為0.69±0.18、1.27±0.36，證實骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1沉默模型建立。

2.2.2 沉默MALAT1表達的骨肉瘤細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。參照Transwell小室說明書，常規(guī)包被底部膜，水化；取轉(zhuǎn)染48 h的MALAT1沉默組和對照組細胞，調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，分別接種于Transwell上室中。上室內(nèi)加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，下室內(nèi)加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細胞，沖洗、固定、染色后倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。每組鋪6個Transwell 小室，取其平均值。結(jié)果顯示MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組穿膜細胞數(shù)分別為(54±9)、(134±16)個，兩組比較P<0.01。

2.2.3 沉默MALAT1的骨肉瘤細胞ROCK1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取轉(zhuǎn)染48 h的MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取200 μL樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜。封閉1 h后，分別加入anti-ROCK1一抗(稀釋比例為1∶2 000)或anti-GAPDH一抗(稀釋比例1∶500)，孵育過夜；次日加入HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶2 000)，孵育1 h。參照ECL試劑盒說明書行電化學發(fā)光檢測，采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以ROCK1與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值計算ROCK1蛋白相對表達量。 結(jié)果顯示，MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組ROCK1蛋白相對表達量分別為0.36±0.07和1.06±0.11，兩組比較P<0.01。

2.3 ROCK1過表達對骨肉瘤細胞侵襲能力的影響

2.3.1 過表達ROCK1的骨肉瘤細胞模型建立 胰酶消化后接種于6孔板中，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔。將骨肉瘤細胞隨機分為MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組，培養(yǎng)24 h后分別參照LipofectamineTM3000說明書轉(zhuǎn)染MALAT1-siRNA質(zhì)粒、con-siRNA質(zhì)粒、MALAT1-siRNA+oe-ROCK1質(zhì)粒、MALAT1-siRNA+pcDNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h采用Western blotting法(具體步驟參照2.2.3)檢測四組ROCK1蛋白相對表達量。結(jié)果顯示，MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組ROCK1蛋白相對表達量分別為0.43±0.11、1.21±0.17、1.86±0.27、0.47±0.13。對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組(P均<0.01)；對照組與MALAT1沉默+ROCK1過表達組比較、MALAT1沉默組與MALAT1沉默+ROCK1對照組比較P均>0.05。證實過表達ROCK1的骨肉瘤細胞模型建立。

2.3.2 過表達ROCK1的骨肉瘤細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗(具體步驟參照2.2.2)檢測四組細胞侵襲能力。結(jié)果顯示，MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組穿膜細胞數(shù)分別為(52±7)、(128±14)、(196±14)、(56±7)個；對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組(P均<0.01)；對照組與MALAT1沉默+ROCK1過表達組比較、MALAT1沉默組與MALAT1沉默+ROCK1對照組比較P均>0.05。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA在表觀遺傳調(diào)控中扮演了重要角色[8]。非編碼RNA可分為lncRNA和微小RNA，lncRNA是指長度超過200 nt的一大類轉(zhuǎn)錄本[9]。MALAT1位于人染色體11q13.1，最初發(fā)現(xiàn)時被認為是肺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關的標志物之一[10]。Cai等[11]報道，lncRNA MALAT1在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用，并可作為骨肉瘤治療的靶基因。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在小細胞肺癌組織及細胞系中表達升高，下調(diào)其表達可抑制肺癌ACC-LC-319細胞的侵襲能力。Wang等[13]在一項胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1可通過調(diào)控SF2/ASF 通路促進胃癌細胞SGC-7901增殖。Li等[14]報道，lncRNA MALAT1在胰腺癌組織中表達升高，其表達上調(diào)可促進胰腺癌的進展。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1相對表達量高于成骨細胞，提示MALAT1在骨肉瘤的發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究MALAT1沉默組MALAT1相對表達量、細胞侵襲能力均低于對照組，提示沉默骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1表達可降低其侵襲能力，初步證實lncRNA MALAT1與骨肉瘤細胞侵襲有關。

ROCK1是一種小分子G蛋白[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1參與了包括結(jié)直腸癌、骨肉瘤等腫瘤的局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16,17]。Luo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1在甲狀腺癌組織中表達升高并與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處器官轉(zhuǎn)移、侵及甲狀旁腺及血管等密切相關，上調(diào)其表達可提高甲狀腺癌細胞的侵襲能力。Wang等[19]報道，ROCK1在骨肉瘤中表達升高，通過上調(diào)miR-335、下調(diào)ROCK1表達可抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力。既往研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1在骨肉瘤組織中表達增高，高表達的ROCK1與骨肉瘤患者預后不良密切相關，而抑制ROCK1表達可降低骨肉瘤細胞的侵襲能力[19～21]。本研究結(jié)果顯示，對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組ROCK1蛋白表達及細胞侵襲能力均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組；提示在lncRNA MALAT1沉默的骨肉瘤細胞中轉(zhuǎn)染ROCK1過表達載體質(zhì)粒oe-ROCK1后，骨肉瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力重新得到了加強，初步證實lncRNA MALAT1對骨肉瘤細胞侵襲能力的調(diào)控作用是通過調(diào)控ROCK1表達實現(xiàn)的。

綜上所述，骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1表達升高，lncRNA MALAT1可能通過調(diào)控ROCK1表達而參與骨肉瘤細胞侵襲。骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個涉及多通路多因子多機制的復雜的生物學行為過程，本研究僅初步探討了lncRNA MALAT1在骨肉瘤細胞MG-63中的表達及其對ROCK1介導的MG-63細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，而lncRNA的作用機制比較復雜，MALAT1參與ROCK1介導的骨肉瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體作用機制還有待于進一步深入研究。