嬰兒型糖原貯積?、蛐突蛐捅硇拖嚓P(guān)性分析和出生缺陷預(yù)防

，，5

(1 西安交通大學附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)心內(nèi)科，陜西 西安 710003； 2 空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；3 西安交通大學附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)超聲科； 4 陜西省兒科疾病研究所； 5 西安市兒童健康與疾病重點實驗室)

糖原貯積病Ⅱ型(GSDⅡ)又稱龐貝病，發(fā)病率約為1/40 000[1]，是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。其發(fā)病機制為位于17q25.3染色體上編碼酸性α-葡糖苷酶(GAA)的基因發(fā)生突變，使溶酶體內(nèi)GAA缺乏，致糖原不能轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而在骨骼肌、心肌和平滑肌等組織細胞內(nèi)大量沉積[2]。本研究對2016年12月—2017年5月于西安市兒童醫(yī)院心內(nèi)科確診的4例伴有肥厚型心肌病的GSDⅡ病兒的臨床特點、GAA活性以及GAA基因進行分析，總結(jié)臨床表現(xiàn)、酶學特點和基因變異的相互關(guān)系，并對下一胎進行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年12月—2017年5月西安市兒童醫(yī)院心內(nèi)科確診的GSDⅡ住院病兒4例,男3例,女1例，發(fā)病年齡為2～8月齡，確診年齡為2～9月。4例病兒均因呼吸道感染就診，有明顯的運動發(fā)育遲緩或伴語言發(fā)育落后，主要為四肢無力、肌張力低下，累及四肢、軀干肌，面肌未受累。4例呼吸肌無力，均有心肌受累；舌體肥大2例；4例伴有肝大。4例肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)均升高，達正常值3～10倍。4例進行了心電圖檢查，提示PR間期80～90 ms，雙心室肥厚。1例肌電圖檢查示肌源性損害。4例病兒心臟B超均示左心室增大，左心室壁彌散性增厚，左心室后壁內(nèi)膜增厚，提示肥厚型心肌病。病兒分別來自4個不同家庭，父母均非近親婚配，無遺傳病家族史，因呼吸道感染、心臟超聲發(fā)現(xiàn)心肌肥厚就診。臨床資料包括病史、心電圖、超聲心動圖、心臟核磁共振、心肌酶、肝腎功及GAA酶活性檢查和基因檢測。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準同意，病兒家長均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1GAA酶活性測定 外周血白細胞用生理鹽水重懸，取20 μL白細胞懸液(約2 μg蛋白)加入80 μL反應(yīng)體系(1 mmol/L 4-甲基傘形酮-α-D-葡萄糖苷，pH 4.3的50 mmol/L醋酸鈉緩沖液，1 g/L的Triton X-100，10 μmol/L阿卡波糖)中，37 ℃水浴反應(yīng)2 h。加入pH 10.7的0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液150 μL終止反應(yīng)。檢測反應(yīng)體系熒光(BioTek SynergyH4多功能酶標儀)激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm。空白對照為相同條件，反應(yīng)體系中不加蛋白。配置不同濃度的4-甲基傘形酮，繪制標準曲線，按照標準曲線計算出產(chǎn)物濃度。蛋白濃度用Bradford法測定。

1.2.2基因組DNA的提取和GAA基因突變分析基因組DNA的提?。翰杉杭捌涓改竿庵苎? mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA，放至-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。高通量測序(病兒2)：將先證者的基因組DNA送至北京信諾百世醫(yī)學檢驗所進行心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)基因panel的靶向捕獲二代測序，對二代測序所分析出的候選基因突變位點在家系內(nèi)進行Sanger測序驗證。Sanger測序(病兒1、3、4)：依據(jù)NCBI GAA基因 (NM_000152.3)序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，擴增GAA基因的20個外顯子序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共進行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后采用ABI 3500dx儀器進行雙向測序。產(chǎn)前基因篩查：針對家庭內(nèi)有明確基因診斷的病兒母親在孕7～12周采集絨毛膜，或者于孕16周后行羊膜穿刺，抽取羊水，提取基因組DNA。按照上述Sanger測序的方法，對相應(yīng)的突變位點所在的外顯子進行PCR擴增及Sanger測序，并對測序結(jié)果進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 GAA酶活性

病兒1、2和3 GAA的活性分別為2.5、2.1和1.9 nmol/(g·min)，病兒4未行GAA活性測定。見表1。

2.2 GAA基因突變分析

4例病兒均為復合雜合突變，分別來自于病兒父親和母親(見表1)。在檢測到的8個突變中有5個錯義突變，3個插入突變，根據(jù)生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster致病性分析以及美國ACMG指南[3]預(yù)測，其中7個突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?，病?攜帶的p.L701P突變預(yù)測為可疑致病，結(jié)合病兒GAA活性的檢測結(jié)果，確定為致病性的突變。而在已經(jīng)檢測出的突變位點中，p.L701P、p.W279C、p.N535Qfs*3突變位點在HGMD數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻中均未見報道。4例病兒均攜帶復合雜合突變，符合常染色體隱性遺傳，突變測序峰圖見圖1。

2.3 治療、隨訪以及產(chǎn)前GAA基因突變檢測

1例病兒接受Myozyme GAA酶替代治療1個月，其余3 例病兒均未接受酶替代治療。4例病兒確診后2～6個月內(nèi)均死亡，死亡原因為肺部感染、肺不張合，導致呼吸循環(huán)衰竭。2例病兒母親孕下一胎，于妊娠期行羊水穿刺胎兒GAA基因檢測，病兒3母親孕13周絨毛膜致病基因檢測確診胎兒攜帶GAA c.837G>C和c.1598-1599insC復合雜合突變，終止妊娠。病兒1母親孕18周羊水穿刺GAA檢測確定胎兒攜帶一個雜合突變，遺傳咨詢結(jié)果考慮胎兒不會發(fā)病，現(xiàn)已經(jīng)足月娩出，出生體質(zhì)量約3.4 kg，健康。

A、B、C、D分別為病兒1、2、3、4。

圖14例病兒GAA突變位點測序圖

3 討 論

GSDⅡ分為早發(fā)型 (嬰兒型)及晚發(fā)型 (青年型及成人型)。晚發(fā)型GSDⅡ多青少年起病，表現(xiàn)為肌力減退和呼吸肌受累等癥狀，罕見心肌受累[4]。早發(fā)型嬰兒期起病，癥狀嚴重，心肌受累的超聲心動圖表現(xiàn)為以左心室心肌肥厚為主的雙心室心肌向心性肥厚，多在1歲以內(nèi)死于心力衰竭。由于嬰兒型早期臨床表現(xiàn)非特異、進展迅速、診斷治療時間窗短[5]，早期快速做出正確診斷對病兒的治療和預(yù)后有重大意義。本組報道的4例病兒發(fā)病年齡均在1歲前，伴有肥厚型心肌病和骨骼肌受累，故為早發(fā)型GSDⅡ。

GAA基因突變影響GAA的合成、磷酸化修飾、轉(zhuǎn)運以及分泌，突變性質(zhì)決定殘余GAA活性，GAA活性越低，發(fā)病年齡越早，臨床表現(xiàn)越嚴重[6]。嬰兒型病兒皮膚成纖維細胞的GAA活性常低于正常對照的1%，而晚發(fā)型殘余酶的活性可達1%～40%[7]。國內(nèi)有報道幼年起病的晚發(fā)型GSDⅡ型病兒，但無心肌肥厚表現(xiàn)[8]。而本組4例病兒均有明顯的心肌肥厚，心功能有不同程度的降低，血肌酸激酶升高較顯著，提示該4例病兒屬于典型的嬰兒型GSDⅡ。

GAA基因的突變型與臨床表型相關(guān)，在該組病兒1中發(fā)現(xiàn)的GAA基因c.1822C>T，p.R608X雜合突變?yōu)镠GMD報道的已知致病性突變[9-10]；而c.2102T>C，p.L701P雜合突變既往未見報道，生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster均預(yù)測該突變可能有害，病兒1臨床發(fā)病，證實了p.L701P為致病突變。病兒2攜帶的GAA基因c.1822C>T,p.R608X雜合變異，為HGMD報道的與GSDⅡ相關(guān)的已知變異，人群樣本數(shù)據(jù)篩查在個例病人中檢出上述變異[11-14]，該變異為無義變異，造成終止密碼提前出現(xiàn)，提示該變異可能對蛋白多肽鏈的正常合成有重要影響，該變異在外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(ExAC)中的頻率為0.00002479，定義為致病性變異。KOBAYASHI等[15]通過將重組GAA (rGAA)對病人進行體內(nèi)置換治療，發(fā)現(xiàn)可以減輕早期病人的癥狀。病兒2攜帶的另外一個GAA基因c.2662G>T,p.E888X雜合變異為HGMD報道的與GSD相關(guān)的已知變異[15-18]。p.E888X在ExAC中的頻率為0.00002，為致病性變異。本組病兒中有2例攜帶p.E888X，進一步證實該突變?yōu)闊狳c突變。病兒3 GAA外顯子4和11分別檢測到一個雜合突變位點c.837G>C，p.Trp279Cys和c.1598-1599insC，p.N535Qfs*3，這兩個位點在HGMD數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻中均未見報道。 c.837G>C突變導致GAA蛋白的第279位氨基酸由色氨酸(Trp)變?yōu)榘腚装彼?Cys)，通過http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/預(yù)測其為可能致病。c.1598-1599-insC為移碼突變，導致GAA蛋白翻譯到第537位氨基酸時終止，形成一個不成熟的蛋白截短體，影響蛋白正常功能的發(fā)揮，通過http://www.mutationtaster.org/預(yù)測該位點為極有可能致病。家系驗證結(jié)果顯示，受檢者的父親和母親分別攜帶c.1598-1599insC和c.837G>C，符合遺傳共分離規(guī)律。病兒4樣本分析顯示GAA基因有2個雜合突變，即c.1802C>T，p.S601L雜合突變以及c.2662G>T，p.E888X雜合突變。這兩個位點均為HGMD報道與GSDⅡ相關(guān)的疑似致病性突變[19]。

表1 病兒GAA基因突變結(jié)果

GSDⅡ為常染色體隱性遺傳，病兒分別攜帶來自父母的致病突變方可發(fā)病，絨毛、羊水和胎兒血均可提取胎兒DNA用于產(chǎn)前遺傳病診斷。妊娠7～12周可以選擇絨毛膜，縮短診斷周期。妊娠14～22周可以選擇羊水穿刺，羊水取材安全性高、結(jié)果準確。如果妊娠超過22周，可以用胎兒血培養(yǎng)。胎兒血培養(yǎng)成功率高，染色體核型形態(tài)好、分裂相多[20]。本組病兒中2例母親孕下一胎，1例妊娠13周取得絨毛膜進行GAA測序后發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶2個致病位點，終止妊娠。 1例在妊娠18周行羊水穿刺，GAA基因檢測確定胎兒只攜帶一個致病基因，繼續(xù)妊娠，順利分娩正常新生兒。

綜上，嬰兒發(fā)病GSDⅡ病兒分別攜帶來自父母的致病突變，病兒癥狀出現(xiàn)早，未經(jīng)酶替代治療死亡率高。GSDⅡ在我國尚未列入產(chǎn)前篩查，對于病兒母親孕下一胎胎兒進行GAA基因檢查，有助于GSDⅡ出生缺陷的預(yù)防。

(感謝西安交通大學附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)、陜西省兒科疾病研究所楊穎、張李鈺對本文基因檢測結(jié)果分析的幫助)