應用血栓彈力圖評價烏司他丁的體外抗凝作用

宋景春，胡 煒，楊 洋，林青偉，曾慶波，鄧星平

0 前 言

烏司他丁(ulinastatin, UTI)是從健康男性尿液中提取的酸性糖蛋白，由143個氨基酸組成，相對分子質量約 67 000，屬蛋白酶抑制劑[1]。烏司他丁對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶具有良好的抑制作用,并能減少中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放，穩定溶酶體膜并抑制溶酶體酶的釋放[2-3]。藥品說明書限定烏司他丁主要用于治療急性胰腺炎和急性循環衰竭的搶救，推薦劑量為每次10萬IU靜脈注射，1天3次[4]。另有研究報道烏司他丁具有很強的抗炎作用，并在膿毒癥、感染性疾病、腎病、體外循環和腫瘤等疾病領域也有良好的療效，使用劑量上甚至有使用每日1000萬IU持續靜脈注射的報道，但這種超適應證和超劑量的使用方法，迄今仍缺乏有力的實驗證據[5-8]。究其原因，難以廣泛開展超適應證、超劑量使用烏司他丁進行高質量的臨床研究至關重要。

血栓彈力圖儀(thromboelastography，TEG)是針對全血標本的凝血檢測設備，能夠在體外通過測定血栓形成速度、強度和溶解過程，真實而全面地反映凝血功能狀態[9-10]。因此，本研究擬嘗試通過血栓彈力圖儀在體外評價超劑量烏司他丁對健康人群凝血狀態的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象選擇年齡≥18歲的健康志愿者20名，年齡22～38歲，平均年齡(27.6±5.04)歲。其中男10名，平均年齡(29.3±6.2)歲；女10名，平均年齡(25.9±2.96)歲。排除標準：具有遺傳性凝血病或其他影響凝血功能的疾病，3個月內有服藥史。所有對象均空腹從肘靜脈采血4 mL，置于枸櫞酸抗凝管中(枸櫞酸血液比例為1∶9)。將10萬單位烏司他丁溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液，配成100 IU/μL的烏司他丁溶液。將每名志愿者的4 mL靜脈血分為1 mL血標本4份，根據烏司他丁的使用劑量設置空白對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。其中空白對照組按說明書進行常規檢測，低、中、高劑量組分別加入10、20、40 μL烏司他丁溶液至1 mL血標本中，低、中、高劑量組烏司他丁終濃度依次為1000、2000、4000 IU/mL。根據性別設置亞組分析，分為男性空白對照組及低、中、高劑量組和女性空白對照組及低、中、高劑量組。本研究獲得醫院倫理委員會批準(批準號：LC2018005)，所有志愿者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1儀器和試劑血栓彈力圖儀(西芬斯，北京樂普醫療科技)及配套試劑(包括高嶺土試劑瓶、0.2 mol/L氯化鈣和普通杯等),烏司他丁(廣東天普生化醫藥)，0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2血栓彈力圖檢測按說明書操作步驟進行，所有血樣本均在40 min內完成TEG監測。測試完畢后，記錄血栓彈力圖的主要參數，包括凝血反應時間(R)、血塊形成速率(K)、血塊形成動力學(α角)、血塊最大強度(MA)和凝血綜合指數(CI)。R時間反映參加凝血啟動過程的凝血因子的綜合作用，正常范圍為4～8 min。K時間是從R時間終點到描記幅度達到20 mm所需的時間，反映血凝塊形成的速率，代表纖維蛋白聚合并與血小板交互反應形成血塊的過程，正常值為1～4 min。α角是從血凝塊形成點到描記圖最大的曲線弧度處作切線與水平線的夾角，正常范圍為47°～74°。α角與K時間密切相關，影響因素均為纖維蛋白原和血小板。MA反映血凝塊的最大強度，主要受血小板和凝血因子XⅢ的影響，正常值為55～73 mm。CI反映樣本在各種條件下凝血的綜合狀態，<-3為低凝，>+3為高凝。

2 結 果

2.1不同劑量烏司他丁對健康人血栓彈力圖參數的影響與空白對照組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組R值和K值均顯著延長(P<0.05)，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。與低劑量組比較，中劑量組R值和K值顯著延長，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。同樣與低劑量組比較，高劑量組的R值顯著延長(P<0.05)，MA和CI顯著降低(P<0.05)，中劑量組和高劑量組在各項指標上差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2不同劑量烏司他丁對健康男性血栓彈力圖參數的影響與男性空白對照組比較，男性低劑量組R、K、α角、MA和CI參數差異均無統計學意義(P>0.05)。與男性空白對照組和男性低劑量組比較，男性中劑量組和男性高劑量組的R值和K值均顯著延長(P<0.05)，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3不同劑量烏司他丁對健康女性血栓彈力圖參數的影響與女性空白對照組比較，女性低、中、高劑量組的R值和K值均明顯延長(P<0.05)，α角、MA值和CI均顯著降低(P<0.05)。但女性低、中、高劑量組各組間的R值、K值、α角、MA和CI差異無統計學意義 (P>0.05)。見表2。

3 討 論

烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑, 有報道烏司他丁可改善膿毒癥患者免疫、心臟及其他各臟器功能,臨床上已用于抗急性組織損傷、減弱炎癥損害等方面[11-12]。近年來有相關文獻報道烏司他丁對凝血系統也有一定的影響，如Ge等[13]報道烏司他丁可以糾正血液的高凝狀態，降低手術后下肢深靜脈血栓(DVT)的發生率。Kim等[14]報道烏司他丁可能通過延長體外循環(CPB)后患者的凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)，從而影響凝血功能。臨床上經實踐大劑量烏司他丁治療彌散性血管內凝血(DIC)有效[8]，但具體的機制并不清楚，也缺乏標準。TEG是一種接近人體生理水平和內環境的檢測方式，其通過微量的全血檢測能對凝血因子、纖維蛋白原、血小板聚集功能以及纖維蛋白溶解等方面進行凝血全貌的檢測和評估。本研究即采用TEG評價不同劑量烏司他丁的體外抗凝作用。

組別R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI空白對照組7.97±1.74 2.20(1.80, 3.08)55.17±10.3760.92±5.32-2.27±2.58低劑量組10.27±1.72?3.60(2.65, 3.88)?48.38±9.29?56.01±5.54?-5.23±2.28?中劑量組11.96±2.61?#4.90(3.43, 5.58)?#39.58±11.03?#47.68±6.94?#-8.56±3.49?#高劑量組12.66±2.42?#3.75(2.88, 5.15)?44.84±10.33?50.10±7.95?#-8.03±3.47?#與空白對照組比較,?P<0.05;與低劑量組比較,#P<0.05

組別R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI男性 空白對照組9.22±1.312.98±0.8447.71±8.4958.93±5.19-4.08±2.02 低劑量組10.47±2.113.26±0.7849.80±7.7657.02±5.81-5.08±2.39 中劑量組13.25±2.58?#5.64±1.26?#33.42±8.29?#45.01±3.28?#-10.51±3.03?# 高劑量組13.73±1.99?#4.35±1.46?#△42.29±8.37?#△48.39±5.68?#-9.26±2.68?#女性 空白對照組6.71±1.091.99±0.4462.63±5.5962.90±4.92-4.05±1.63 低劑量組10.07±1.55▲3.42±0.85▲46.96±10.83▲55.00±5.37▲-5.37±2.29▲ 中劑量組10.66±2.00▲3.99±1.86▲45.73±10.20▲50.35±8.66▲-6.60±2.83▲ 高劑量組11.59±2.42▲3.73±1.42▲47.39±11.87▲51.81±9.73▲-6.80±3.85▲與男性空白對照組比較,?P<0.05;與男性低劑量組比較,#P<0.05;與男性中劑量組比較,△P<0.05;與女性空白對照組比較,▲P<0.05

凝血因子、血小板和纖維蛋白原在止血和血栓形成過程中各自扮演著重要角色。血小板是一期止血的基礎，為凝血系統活化及凝血酶的最終形成提供磷脂表面，并且活化血小板可釋放多種促凝物質；纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，作為凝血因子I直接參與凝血過程，其被凝血酶裂解后形成的纖維蛋白單體，是血栓的重要成分，同時纖維蛋白原是參與血小板聚集的重要輔助因子，在激活的血小板之間作為橋梁與血小板膜上的糖蛋白受體(GpⅡb/Ⅲa)結合，從而促進血小板聚集和血栓形成[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量組的R值和K值均顯著延長，α角、MA和CI均顯著降低，說明烏司他丁能改變血塊的動力學，通過抑制凝血因子活性、降低纖維蛋白原和血小板功能方面產生低凝效應。中劑量和高劑量組的R值較低劑量組延長，MA和CI降低，提示隨劑量的增加，烏司他丁對凝血因子活性和血小板功能抑制作用增強。

凝血因子多是絲氨酸蛋白酶，其活性部位均含有一個必不可少的絲氨酸殘基。烏司他丁是絲氨酸蛋白酶抑制劑，能通過抑制凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅻ等的過度激活從而減少凝血因子的消耗。這是烏司他丁抗凝作用的機制之一。Pugia等[16]報道烏司他丁第二個Kunitz結構域能夠影響凝血因子, 尤其是X因子活性，同時還可以抑制血小板聚集。Nishiyama等[17]報道腹部手術前應用烏司他丁可以降低術后纖維蛋白降解產物(FDP)、纖溶酶-纖溶酶原抑制物復合物(PIC)和凝血酶-抗凝血酶復合物(TAT) 水平，抗凝血酶(AT)下降的幅度也較未使用烏司他丁的患者要低。這些研究結果均與本研究的結論相符。

對于健康男性，與對照組比較，低劑量組的各參數無統計學意義；但中劑量組的R值與K值延長，α角、MA和CI均降低；高劑量組的R值顯著延長，MA和CI均顯著降低，α角無顯著差異。這說明烏司他丁劑量增加到2000 IU/mL時，才對男性具有顯著的抗凝作用。而對于健康女性，與對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量組的R值和K值延長，α角、MA和CI降低，然而低劑量組、中劑量組與高劑量組之間各參數無統計學意義。這說明1000 IU/mL的烏司他丁就對女性具有明顯的抗凝作用，但隨著劑量的增加，其抗凝作用并未增強。由此可見，烏司他丁劑量敏感性存在性別差異，該差異性可能與烏司他丁是從男性尿液提取的制作的因素有關。同時，這種差異性對臨床上應用烏司他丁進行個體化治療具有一定的指導意義。此外，如果按照人均3000 mL有效血容量計算，本研究采用的每毫升全血容納1000 U、2000 U和4000 U的烏司他丁約相當于在體單次300萬、600萬和1200萬的烏司他丁劑量，如果考慮首過效應，可能達到本試驗相應血藥濃度的劑量更高。這也為臨床專家經驗性大劑量使用烏司他丁臨床有效，提供了一定的臨床證據。

綜上所述，通過血栓彈力圖我們觀察到大劑量的烏司他丁有體外抗凝作用，這種抗凝作用體現在抑制凝血因子活性、降低纖維蛋白原及血小板功能，且與劑量與性別相關。在體內的抗凝效果如何，尚需要進一步研究證實。