300例基質金屬蛋白酶-91562基因多態性與急性腦梗死的關系探討*

李艾帆，張玉超，李永芳，馬西文，曹心慧,賀 穎，鄭 紅，許予明

(1.河南大學附屬鄭州市第一人民醫院神經內科，鄭州 450000；2.河南大學附屬鄭州市第一人民醫院優生遺傳科，鄭州 450000；3.鄭州大學附屬鄭州市中心醫院老年病科，鄭州 450001；4.鄭州大學基礎醫學院醫學遺傳與細胞生物學系，鄭州 450052；5.鄭州大學第一附屬醫院神經內科，鄭州 450001)

腦卒中是世界范圍內導致殘疾和死亡的重要原因，以其高發病率、高致殘率和高病死率受到普遍關注。隨著人類平均壽命的逐漸延長，其發病率還在逐年上升。流行病學研究資料表明,我國腦卒中發病率為170.3/10萬,其中80%為缺血性腦卒中。一些研究顯示腦梗死有明顯的家族聚集傾向，一級親屬發病率增高和雙生子女發病一致性的研究結果也提示遺傳因素與腦梗死發病密切相關。目前從分子遺傳學水平解釋腦梗死的發病本質和遺傳規律是國內外腦血管病研究的熱門課題[1-4]。本課題通過檢測中國河南漢族人基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase，MMP-9)-1562C/T位點的基因多態性，探索MMP-9基因多態性與急性缺血性腦卒中的關系，為精準預防和個體化干預提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月到2016年7月在鄭州市第一人民醫院神經內科住院的急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)患者300例，男 163例，女 137例，平均年齡(59.69±12.55)歲；對照組為同期門診體檢的健康者300例，男145 例，女 155例，平均年齡(58.69±11.71)歲，其性別、年齡與病例組相比差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。病例組的納入標準：(1)發病2周內的急性腦梗死患者，ACI的診斷符合《2014年中國急性缺血性腦卒中診斷標準》，經臨床檢查(體征、病史、CT/MRI)確診。(2)mRS評分0～1分患者；(3)患者簽署知情同意書。本研究獲得醫院倫理委員會的批準。ACI根據TOAST分型，分為如下3個亞組：大動脈粥樣硬化型(LAA)、小動脈閉塞型(SAO)及其他原因型(SUE，包括心源性栓塞、煙霧病及無明確原因型)。其中大動脈粥樣硬化型腦梗死117例，小動脈閉塞性腦梗死168例，其他原因型15例，包括心源性栓塞8例，煙霧病2例，不明原因型5例；均為無血緣關系的河南地區漢族人群，無腦卒中家族史。排除標準：(1)出血性腦梗死、陳舊性或無癥狀性腦梗死患者；(2)合并其他精神疾病無法合作或不能合作者；(3)以上兩組均排除嚴重感染、癲癇、惡性腫瘤、血液或其他系統嚴重或進行性疾病及肝腎功能不全者。

1.2方法

1.2.1引物 引物設計參照文獻[5]，上游引物：5′-GCC TGG CAC ATA GTA GGC CC-3′;下游引物：5′-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3′。

1.2.2基因組DNA提取 采集所有患者外周靜脈血2 mL,采用EDTA抗凝及酚、氯仿法提取人基因組DNA，無水乙醇沉淀后，加60 mL ddH2O溶解。

1.2.3基因型分析 以多聚酶鏈反應限制性內切酶長度多態性(PCR-RFLP)分析MMP-9 1562基因型

1.2.3.1MMP-9 1562基因特定片段PCR擴增 PCR反應體系為50 μL:STR Buffer(包含Mg2+,dNTP,10×Buffer)2.5 μL,上、下游引物各1.0 μL,Taq酶0.3 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 37.7 μL。PCR擴增條件：(1) 95 ℃預變性5 min；(2)30個循環擴增94 ℃ 1 min,63 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min；(3)72 ℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠(EB)染色檢驗擴增結果。

1.2.3.2限制性內切酶酶切PCR擴增產物 酶切反應體系為20 μL，包括PCR擴增產物6 μL，Sph I 1 μL,10×Buffer R 2.0 μL,ddH2O 11 μL。酶切產物在37 ℃水浴鍋中溫浴4 h。

1.2.3.3電泳檢測 酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，取6 μL擴增產物加入2%瓊脂糖凝膠負極端的加樣孔，以溴酚藍為指示劑，EB為染色劑，在100 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.2.3.4準確性 為檢驗基因分型結果的準確性，本試驗隨機抽取已分型的3種基因型的部分樣本進行基因測序。

2 結 果

2.1病例組和對照組的一般臨床資料 傳統的危險因素如糖尿病、高血壓等在病例組的比例均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 病例組和對照組臨床特征的比較

2.2MMP-9-1562位點的凝膠電泳圖 PCR擴增產物大小為435 bp的片段，1562C/T突變后被Sph I識別，野生型CC基因型只有435 bp一個片段。雜合子產生3個片段：435、247、188 bp，純合子突變TT基因型產生247 bp和188 bp兩個片段，電泳圖見圖1。

圖1 MMP-9 -1562 C/T突變電泳圖譜

2.3MMP-9-1562位點測序結果 實驗結果顯示，基因分型結果與測序結果完全一致，圖2為該位點的3種基因型測序圖。

圖2 3種基因型測序圖

2.4MMP-9-1562位點多態性分型結果 運用SHEsis軟件檢測發現，MMP-9基因位點-1562多態性基因型分布在病例組和對照組中處于Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。病例組MMP-9-1562的基因型和等位基因頻率分布結果見表2，結果顯示病例組中的CT、TT基因型頻率與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，病例組T等位基因分布與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。在顯性和隱性模式中，病例組中的CT+TT基因型和TT基因型頻率與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 基因型頻率與等位基因頻率在兩組間的比較[n(%)]

2.5MMP-9-1562位點多態性與ACI亞型的相關性 ACI亞型中MMP-9-1562基因型頻率及T等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 病例組各亞型基因型頻率與等位基因頻率比較

表4 腦梗死危險因素的多元逐步Logistic回歸分析

2.6MMP-9-C1562T位點多態性基因型與腦梗死的關系 采用Logistic回歸模型進行多因素分析，腦梗死是否發生作為因變量，將MMP-9-C1562T多態性、Hcy水平、高血壓、糖尿病、高脂血癥作為自變量，結果顯示高脂血癥、高血壓、糖尿病、Hcy水平可以增加腦梗死的發病風險，而MMP-9-C1562T基因多態性不增加腦梗死的發病風險，見表4。

3 討 論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理學基礎。動脈粥樣硬化是由多因素導致的慢性炎癥，動脈粥樣斑塊破裂可以導致急性心肌梗死或急性腦梗死的發生。易損斑塊很薄、炎性且含有高水平的膠原纖維帽，而這些纖維帽的形成與基質金屬蛋白酶 (MMPs)的濃度有關[5]。MMPs通過對細胞外機制的降解和重塑，從而促使單核細胞和平滑肌細胞遷移，最終導致斑塊纖維帽的降解和斑塊的破裂[6-8]。研究表明：基質金屬蛋白酶的水平和它的活性與心腦血管疾病密切相關，其中MMP-2和MMP-9(分別為明膠酶A和明膠酶B)在缺血時變化更明顯[9]，因此,推測遺傳基因多態性存在，編碼MMPs的基因可能會影響其循環水平，使患者更易于罹患心腦血管疾病。

MMP-9又稱明膠酶B是MMP家族中最重要的成分，參與了血管的再生、炎癥反應等病理過程，在動脈粥樣硬化、腦缺血及再灌注損傷時MMPs 表達增加[9]，導致大量細胞外基質降解，削弱了斑塊纖維帽，促進了斑塊的形成，也加速了動脈粥樣硬化的發生與發展[10-12]。

MMP-9 C1562T是MMP9基因轉錄啟動子上游 1562位點處存在的一個重要調控元件。國外有研究報道，當此位點 C→T 后，可從轉錄水平影響基因表達調控酶蛋白合成的數量，最終引起啟動子活性相對增強，蛋白質表達數量相對增加。

周軍等[13]研究發現MMP-9 C1562T CT基因型頻率和T等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義，并且攜帶CT/TT基因型者血漿MMP-9水平較高，顯示中國人中MMP-9 C1562T CT等位基因與腦梗死發病相關。劉筱潔等[14]通過對107例動脈粥樣硬化性腦梗死患者與98例健康對照者檢測基因型發現，腦梗死組CT+TT基因型頻率為28.04%，對照組CT+TT基因型頻率為29.27%，T等位基因頻率在兩組中分別為14.00%和6.63%,兩組差異顯著,提示MMP-9 C1562T基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死相關,T等位基因是動脈粥樣硬化性腦梗死的易感基因。然而，有研究表明MMP-9 C1562T基因多態性與心肌梗死、缺血性腦卒中不存在相關性[15]。本研究應用PCR-RFLP技術對300例急性缺血性腦卒中患者和300例對照組分別進行了MMP-9-1562位點基因型分析。發現CT+TT基因型頻率及T等位基因頻率在兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)。根據TOAST分型，將ACI組分為LAA組、SAO組、SOE組，分別研究MMP-9-1562位點多態性與不同腦梗死亞型的相關性。結果發現在腦梗死亞型中MMP-9-1562基因型頻率及T等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。在調整傳統危險因素后，Logistic回歸分析顯示，高血壓、糖尿病、Hcy水平可以增加腦梗死的發病風險，而MMP-9-C1562T基因多態性不增加腦梗死的發病風險。提示MMP-9-C1562T位點基因突變與急性缺血性腦卒中無明顯相關,MMP-9-C1562T位點突變可能不足以構成腦梗死發病中的一個獨立遺傳性危險因子。與既往研究報道相一致[15]。

腦梗死發病機制復雜，環境因素和遺傳因素共同參與腦梗死的發生、發展。僅僅控制傳統危險因素還不能很好地減少腦梗死的新發或復發風險，因為一些遺傳性危險因素可能會改變其他已知危險因素，從而在腦梗死的發生、發展中發揮重要的作用。因此，需要擴大樣本量，同時檢測基質金屬蛋白酶的水平，進一步探索MMP9基因多態性與腦梗死的關系，明確MMP9基因多態性在腦梗死發生、發展過程中確切的分子遺傳機制。