高原人群鐵調素基因單核苷酸多態性研究*

張勇群,雷 鳴,施 靜,鄧昭敏,何 華,鄔云紅△

(1.西藏自治區人民政府駐成都辦事處醫院，成都 610041；2.西藏大學理學院，拉薩 850000)

鐵調素是由肝臟合成并分泌的抗菌多肽，是調節體內鐵穩態的關鍵物質[1]，與多種疾病有關，因而對鐵調素基因開展全面研究具有重要意義[2-4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)對探索由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，了解疾病病因及病理過程有指導作用[5]。有研究曾表明高原人群中的鐵蛋白含量高于漢族人群[6]，鐵代謝失調可能是主要原因，而鐵調素基因核苷酸多態性在藏族人群對鐵調素基因的表達是否有影響還少見報道。因此，本研究通過對西藏藏族和漢族人群的鐵調素基因(hamp)進行研究，為hamp內含子區SNP與鐵代謝相關疾病是否有關聯奠定基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 自2016年9月1日至2017年8月31日從西藏自治區人民政府駐成都辦事處醫院常規體檢健康者中隨機選取387例，其中藏族197例，漢族190例，年齡18～60歲。研究對象均長期居住在西藏地區，所有研究對象對本研究知情同意。

1.2方法

1.2.1血液收集與DNA提取 用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-K3)抗凝采血管收集所有對象外周靜脈血2 mL，使用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA(天根生化科技有限公司)，-80 ℃保存備用。

1.2.2引物的設計與合成 采用PCR分析方法檢測hamp基因SNP。引物使用Primer5軟件設計(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 6對引物序列及基本信息

1.2.3PCR擴增體系與條件 采用 30 μL的 PCR反應擴增體系，其中包含2×mix(TsingKe)15 μL 、濃度為100 μmol/L的F/R引物各2 μL、濃度為80 μg/mL的DNA模板2 μL和ddH2O 9 μL。反應條件:95℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，特定退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復30個循環。PCR產物經純化后用AB 3730×L Genetic Analyzer測序儀進行測序，測序結果用chromas1.62進行基因型分析。

1.3統計學處理 采用基因直接計算法計算所有SNP位點的基因型和等位基因頻率，并將本研究的基因多態性分布頻率與SNP數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)公布的其他人群(歐洲、非洲、日本和中國北京)的SNP分型數據進行比較，統計分析軟件為SPSS17.0，計數資料用率表示，比較采用χ2檢驗和Fisher′s精確檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1高原人群(西藏)鐵調素基因SNP位點檢測與分析 SNP檢測結果發現，在高原人群中檢測出8個SNP位點，經與NCBI數據庫比對發現，注冊號分別為rs8101606、rs7251432、rs2293689、rs10416533、rs55863037和rs149358257，其中rs7251432位點以AG 基因型最多見，在高原人群中占52.46%；rs10416533位點以TT基因型最多見，在高原人群中占66.67%；rs55863037位點以GG 基因型最多見，在高原人群中占56.07%；rs8101606位點以AA 基因型最多見，在高原人群中占98.19%；rs2293689位點以CC基因型最多見，在高原人群中占89.95%；rs149358257位點以GG 基因型最多見，在高原人群中占99.74%，見表2。

除檢測到的上述6個SNP位點外，本研究發現了2個鐵調素基因的SNP位點，現已提交到SNP數據庫(注冊號KY987517.1、KY987518.1)，見圖1A、B。其中KY987517.1位點以GG基因型最多見，在高原人群中占82.43%，以G等位基因最常見，在人群中占91.21%；KY987518.1位點以AA 基因型最多見，在高原人群中占99.74%，以A等位基因最常見，在人群占99.87%(表2)。

表2 高原人群(西藏)中發現的8個SNP位點基因型頻數及等位頻率[n(%)，n=387]

續表2 高原人群(西藏)中發現的8個SNP位點基因型頻數及等位頻率[n(%)，n=387]

A：KY987517.1 SNP位置；B：KY987518.1 SNP位置

圖1高原人群(西藏)中新發現的2個SNP位點的位置

2.2高原人群(西藏)中藏族與漢族之間的鐵調素基因多態性分布情況 除了在新發現的KY987518.1位點上沒有發現基因型AT的漢族外，其余KY987517.1基因型以及rs8101606、rs2293689、rs149358257、rs7251432、rs10416533、rs55863037的7個位點在高原人群(西藏)的藏族和漢族兩組間分布差異均無統計學意義 (P>0.05)，見表3。

2.3高原人群(西藏)與人類基因組計劃數據庫中4個人群的SNP比較 人類基因組計劃數據庫中的hamp的基因多態性rs8101606、rs7251432以及rs2293689與高原人群(西藏)相比，在這3個SNP位點上與平原人群(北京)相比均差異無統計學意義，而在rs8101606位點上高原人群(西藏)與歐洲人群和非洲人群相比差異有統計學意義，在rs7251432上與日本和非洲人群相比差異有統計學意義，在rs2293689位點上與歐洲和日本人群差異有統計學意義(表4)，這可能與高原人群(西藏)與歐洲、非洲及日本的種族差異有關。

2.4高原人群(西藏)鐵調素基因SNP與千人基因組計劃中5個人群的比較 千人基因組計劃數據庫中的單核苷酸多態性等位基因rs10416533、rs55863037和rs149358257頻率數據，與高原人群(西藏)對比，結果發現，在rs10416533C/T等位基因頻率上與東亞、歐洲、非洲和南亞均差異無統計學意義；在rs55863037A/G等位基因頻率上僅與歐洲人群差異有統計學意義，與其他4個人群均差異無統計學意義；在rs149358257位點的GA基因型只出現在高原人群(西藏)和東亞人群，而歐洲、非洲、美國、南亞人群均未發現(表5)。

表3 高原人群(西藏)中的鐵調素SNP基因型頻率比較[n(%)]

表4 高原人群(西藏)與人類基因組計劃研究的4個人群中鐵調素基因的SNP基因型頻率比較(%)

表5 高原人群(西藏)與千人基因組計劃研究的5個人群中鐵調素基因的SNP等位基因頻率比較(%)

3 討 論

鐵調素是一種由肝細胞分泌后釋放到人血漿的細胞因子誘導的抗菌蛋白，在鐵代謝中起關鍵作用，過多則會促進自由基的產生，引發神經退行性變及多種老年疾病，過少則會造成貧血等多種疾病，給人類的健康造成了極大的影響[7-8]。由于本院普遍存在藏族人群鐵蛋白水平高于漢族人群，這一現象是否與不同民族之間基因型有關，目前還不清楚[9]。為了解不同人群中鐵代謝的差異原因，給臨床治療提供理論基礎，對基因SNP的研究很有必要。因此，本研究開展了高原人群的hamp基因SNP研究，由此來探索高原地區人群與不同人群的基因型與鐵代謝之間的相關性。

本研究中發現高原人群，在rs8101606、rs7251432、rs55863037與人類基因組計劃中公布的人群有統計學差異。本研究還發現在高原人群存在一個rs149358257A/G位點，只在東亞人群中發現，推測rs149358257A/G位點可能是東亞人群所特有的[10]。因此，本研究推測hamp的SNP位點的基因型分布可能與種族差異有關。而在本研究中還未發現hamp的某一SNP位點與鐵蛋白含量失償有關，但有研究表明hamp的SNP位點中rs7251432在膽管閉鎖患者和健康人之間無顯著差異[11]；CHEN等[12]研究發現hamp基因rs7251432位點基因型和等位基因頻率在青藏高原漢族人群丙型肝炎和健康人群之間無顯著差異；LILLVIS等[13]研究發現hamp基因rs7251432A/G位點等位基因頻率分布在腹主動脈瘤患者與健康人群之間有差異。在對肝癌基因進行生物信息學分析中發現hamp為核心基因[14]。由此說明hamp基因與疾病是有一定的關聯的。但是，高原人群(西藏)的鐵蛋白水平的升高是否屬于鐵代謝失調從而引起其他疾病，以及是否會引起其他疾病，在本研究中還未能進行進一步的研究，在后續待收集到足夠多的研究對象將進一步研究高原人群鐵蛋白水平高的機制。利用醫院的優勢對藏區人群進行hamp的SNP位點的研究也是本研究的創新之處。

綜上所述，hamp基因SNP位點基因型和等位基因頻率分布在不同人群中均存在差異，符合遺傳學規律，即親緣關系越遠，其基因型和等位基因頻率差異越顯著，反之則越相似[15]。

目前，越來越多的研究發現，SNP能影響到基因的功能[16]。本研究通過對高原人群hamp基因SNP分型數據研究發現檢測到的8個SNP位點，都位于hamp基因的內含子區，而且，在不同的人群中SNP的頻率存在差異，為研究不同人群hamp基因SNP和鐵代謝相關疾病的發生發展之間的關系提供理論依據，有利于認識臨床上與hamp基因相關的鐵代謝疾病在不同種族和地域所表現出來的差異，進一步為疾病的診斷提供重要的分子遺傳數據。