失神經化骨質疏松動物模型的建立與評價*

黃昌釗，王銳英△，胡譯文

(桂林醫學院附屬醫院：1.四肢創傷骨外科；2.脊柱骨病外科，廣西桂林 541001)

失神經化廢用性骨質疏松是由于肢體骨骼肌肉失神經化營養支配后，因其活動長時間受限或不能，外界應力對骨的刺激減少或消失導致骨量丟失、骨脆性增加及骨組織微結構病變的一種局部或全身的骨質疏松[1]。本實驗通過手術干預致臂叢神經根性損傷從而造成大白兔左側肢體廢用，構建廢用性骨質疏松動物模型。在造模后3個不同時間點對其骨密度、干重、力學性能及骨組織微結構方面進行評價，為失神經化廢用性骨質疏松的研究提供實驗載體。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8個月齡雄性新西蘭長耳白兔(由桂林醫學院科學實驗動物中心提供)24只，體質量3.0～3.5 kg，置于室內寬敞不銹鋼圈籠中(4.5 m×3.5 m×4.8 m)，保證動物籠內自由活動。在圈籠四角放置充足飼料與水，保證實驗動物自由活動時能尋到足夠食物，飼料由桂林醫學院實驗動物中心提供，飲用水為日常使用的自來水?？刂剖覝赜?26±3)℃，濕度50%～60%，定期84消毒液及紫外線室內消毒排風，確保12 h足夠的光照，晝夜交替，適應喂養1星期。

1.2方法

1.2.1動物模型制作與分組 1周后，予以水合氯醛(360 mg/kg)兔耳緣靜脈注射，麻醉成功后，取大白兔仰臥位，頭部及四肢分別用繃帶固定于特制兔手術臺邊緣，脫毛機脫毛術野及周圍皮膚，常規聚維酮碘消毒，鋪單，取左下頜骨經頸向下至胸大肌中部連線中后2/3皮膚切口，顯露胸大肌，分別切斷胸大肌、胸小肌，暴露左鎖骨，于鎖骨下鏡下分離全臂叢神經至神經根孔處切斷并向遠端游離約2 cm切斷后曠置，按解剖層次縫合術口。為預防縫合口感染，術后給予各組80萬U青霉素肌內注射，1次/天，連續應用3 d，同時每日予以傷口換藥1次，從而建立大白兔左側臂叢根性損傷模型。根據術后第4、8、12周3個不同時間點將24只新西蘭大白兔分為3組(每組8只)。繼續圈籠內放養，自由活動。

1.2.2標本獲取 分別于術后第4、8、12周3個時間點采用耳緣靜脈快速注射空氣栓塞法各處死8只兔。仔細解剖雙側肱骨，浮力法測量體積，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.3肱骨生物力學性能測定 取實驗側和對照側肱骨試件,游標卡尺測量長度和直徑。試件兩端樹脂包埋固定，維持試件豎直,包埋深淺均勻一致,保證自凝樹脂基托與試驗機接觸面水平光滑。為避免收集三點彎曲試驗時碎裂的骨組織及實驗過程中試件干燥，采用薄塑料紙包裹試件。固定好的試件于WDW-20型天辰電子萬能試驗機上行三點彎曲試驗。測量彎曲強度極限值，以最大載荷及彈性模量衡量骨強度。壓力加載速率是2 mm/min[2-3]。將兩端固定好的肱骨置于力學試驗機楔形支架上，肱骨凹側面朝上，壓力桿由上向下勻速對肱骨中段施加壓力，直至試件斷裂。用與力學試驗機連接的計算機記錄整個測試過程，結果根據各組所測骨強度指標進行計算。

1.2.4骨密度測定 采用雙能X射線骨密度儀(法國MEDILINK公司)測量不同時間段各組大白兔雙側肱骨骨密度值，檢測時先縱向掃描,顯示肱骨近端形態后,以骨骺線為參照移3.0 mm和12.0 mm處作斷層測定[4]。

1.2.5骨骼重量測定 留取雙側肱骨，剔凈附著于骨質的軟組織，將肱骨全長標本放入烤箱，110 ℃干燥10 h后，用分析天平(精度為0.00 01 g)精確稱取肱骨干重。

1.2.6骨組織形態學檢測 取各組雙側肱骨近端干骺端，10%中性甲醛固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣，行骨標本冠狀面對剖，乙醇順濃度梯度脫水，組織浸蠟及石蠟包埋，6 μm連續切片，行HE和Masson染色，觀察骨組織形態學改變。

2 結 果

2.1骨密度 術后右對照側與左實驗側相比，4、8、12周兔肱骨骨密度值分別由0.69、0.68、0.66 g/cm2降至0.47、0.31、0.19 g/cm2，骨密度值隨著肢體廢用時間的延長，實驗側下降程度明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2肱骨干重 術后3個不同時間點測定兔肱骨全長骨骼干重，左實驗側與右對照側比較，肱骨干重值降低，且下降程度隨肢體廢用時間的延長而加重(P<0.05)。術后各實驗側組間值相比較，肱骨失神經化支配時間越長，骨骼干重值下降程度越顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；各對照側組間比較，肱骨干重值差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各時間點大白兔雙側肱骨骨骼干重值的測定結果

2.3骨力學強度 術后第4、8、12周實驗側與對照側相比，各時間點實驗側骨力學強度指標與對照側相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；各時間點實驗側組間比較，骨質失神經化支配時間越長，上述各變量值下降程度越顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；術后各對照側組間比較，骨強度值差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、3。

表2 各時間點大白兔肱骨彎曲實驗最大載荷、彈性模量及彎曲強度值測試結果

表3 各時間點大白兔肱骨彎曲實驗彈性應力、彈性應變、最大應力、最大應變值測試結果

圖1 術后第4、8、12周各組兔肱骨近端干骺端形態學變化(HE×100)

圖2 術后第4、8、12周各組兔肱骨近端干骺端新生膠原變化(Masson×100)

2.4肱骨組織形態學檢測 術后各時間點對照側肱骨近端干骺端骨小梁連接緊密，粗大無斷裂，孔隙較少，髓腔及破骨細胞數目無異常增多，骨皮質較厚，與對照側組織表現一致(圖1)。相比各時間點實驗側骨小梁結構稀疏、纖細并存在多處斷裂，小梁間吻合程度明顯降低，髓腔容積擴大，破骨細胞數目明顯增多，且隨著觀察時間的延長，上述表現越發明顯(圖1)。為評價骨組織成熟程度，Masson染色顯微鏡下見新生骨膠原大多被染藍色，成熟骨膠原為鮮紅色，結果可見隨著兔左上肢廢用時間的延長，骨質中新生膠原的量明顯在減少，成熟膠原量增多(圖2)。

3 討 論

目前臂叢神經損傷及廢用性骨質疏松患者在臨床診療過程中十分常見，臨床上廢用性骨質疏松也常常繼發于中樞神經系統、脊髓或周圍神經病變或損傷后引起的肌肉癱瘓[5-7]，本研究通過手術構建臂叢根性損傷模型致大白兔左上肢廢用，從而打亂其體內骨形成和骨吸收動態平衡，有研究報道新生骨合成需要成骨細胞介導，骨吸收則依賴于破骨細胞，此骨吸收大于骨形成動態平衡的紊亂，導致骨質發生疏松病變[8-9]。此外，COUPAUD等[10]指出基于人體四肢骨骼中含有極多的神經纖維，神經損傷后喪失了對骨骼的調節功能，骨組織細胞功能表達及骨重塑平衡紊亂，極易導致骨質疏松。

成骨細胞介導的新骨生成減少，而破骨細胞介導的骨吸收增強，導致上肢骨骨質的密度、干重、強度、力學性能及組織形態學結構均隨著廢用時間延長發生不同程度病變，骨折發生率顯著提高[11]。這些指標的改變表明失神經化廢用性骨質疏松的兔模型建立成功。

臨床實驗研究中復制失神經化廢用性骨質疏松動物模型所采取的動物及方式多樣，其中以兔及鼠備受青睞[12]。TROSS等[13]指出8個月齡左右的大白兔其體內二級松質骨的骨骼重建與人類的骨重建特別相似。因此，為了能更好地了解廢用性骨質疏松癥的發病機理，本實驗采用大白兔為動物實驗模型是合理高效的。與其他的廢用性骨質疏松模型比較，失神經營養化廢用引發的局部骨質疏松在臨床表現及病理生理機制上更突出，其導致的骨質丟失起因于骨吸收能力的過表達和骨形成能力的減弱[14]。

ZENG等[15]報道了失神經化支配后骨生成明顯下降，骨吸收增加，骨量丟失在造模術后第4～6周開始發生顯著性廢用性骨質疏松，并在 X 線片上有明顯反映。但有大量研究發現采用大白兔失神經造模后，骨質發生廢用性骨質疏松的時間段并不是一致的，可能與實驗動物的飲食、睡眠、活動情況及身體營養狀況等個體因素相關。同時，失神經化導致廢用性骨質疏松的分子機制復雜，骨骼失神經化后打亂體內骨形成和骨吸收的動態平衡只是導致骨質疏松的機制之一，其骨動態平衡中相關蛋白和生化因子的分子變化機制還需進一步研究。

本實驗研究結合了臨床臂叢神經損傷機理及解剖結構，采用一側兔臂叢神經根性切斷造模方法。結果表明，肱骨失神經化營養支配后，骨密度、干重明顯降低，骨的力學強度指標較對照側明顯減弱，骨小梁致密度、小梁間吻合、骨皮質厚度、孔隙、髓腔、破骨細胞數目及新生膠原纖維數量在不同的廢用時間點與對照側相比差異均有統計學意義。故本研究結果顯示，臂叢神經切斷術是有效建立廢用性骨質疏松動物模型的方法，為廢用性骨質疏松研究提供了良好的實驗載體，也為骨科今后對骨質失神經營養方面的基礎研究及臨床防治提供了較為穩定可靠的實驗基礎。