阿尼芬凈中間體生物轉化工藝研究

吳娟

摘 要：對放線菌來源的棘白霉素脫酰基酶產生菌ECBN的轉化工藝進行研究，通過單菌篩選和轉化時間兩個方面的優化，確定最佳的轉化條件，從而提高轉化效率。

關鍵詞：棘白霉素；阿尼芬凈；轉化效率；優化

棘白霉素類抗生素是21世紀初開發的新型藥物，具有全新的作用機理，抗真菌譜較廣，對念珠菌屬以及曲霉菌屬均有效，無交叉耐藥性，無因其本身作用機制而引發的明顯不良反應，是迄今為止安全性最高的一種抗真菌藥物，也是目前用于治療全身性真菌感染的新型藥物。

近年來，棘白霉素類抗真菌藥發展迅猛，已有卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈等多個廣譜、低毒、高效的新化合物進入了臨床研究 ，[1-3]作為棘白霉素類抗真菌藥物阿尼芬凈和米卡芬凈，它們的合成過程是將其對應的棘白菌素類母核鏈接不同的側鏈形成，其母核的形成是有對應的前體物質棘白霉素B和脫去側鏈產生，因此脫酰基過程對于合成該類藥物至關重要，化學方法反應條件劇烈，選擇性又差，幾乎沒辦法實現，文獻報道可以通過微生物轉化完成，所使用的轉化菌株有游動放線菌屬的菌株，尤其以猶他游動放線菌居多，和鏈霉菌屬的菌株，包括環圈鏈霉菌與一些未確定種的鏈霉菌屬菌株。

以阿尼芬凈中間體ECB為底物，對篩選放線菌來源的棘白霉素脫酰基酶產生菌ECBN的轉化工藝進行研究，通過單菌篩選和轉化時間兩個方面優化，確定最佳的轉化條件，從而提高轉化效率。

1 實驗與方法

1.1 供試菌來源

供試菌來源于本實驗室菌種庫。

1.2 培養基

種子培養基：蔗糖2%，玉米淀粉2%（糊化），棉籽餅粉1%，酵母粉1%，碳酸鈣0.2%，pH6.5。

發酵培養基：蔗糖3%，棉籽餅粉2%，酵母粉2%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鉀0.1%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.2%，pH6.5。

1.3 方法

通過單菌分篩，轉涂斜面，挑選優勢單菌進行搖瓶試驗。分別將單菌接種瓶，種瓶裝量60mL/500mL瓶，30℃，250rpm搖床培養48h。按10%接種量接入發酵培養基，30℃，250 rpm，搖床培養4天。按2000u添加重含40.8%的ECB底物進行轉化試驗，定時取樣，采用HPLC法測定發酵液效價來判斷轉化效率的高低。

1.4 HPLC檢測

高效色譜儀：Agilent Technologies 1260 Infinity，色譜柱：xBridge Amide3.5um，流動相：乙腈-水（含7.8g L-1 NaH2PO4，pH3.0），波長：210 nm，進樣量：10μL，流速：1mL min-1，柱溫：40℃

2 結果與討論

將保藏的棘白霉素脫酰基酶產生菌ECBN，涂平板，自然分篩，挑選出30株單菌進行斜面培養，再通過斜面外觀，菌液，鏡檢，選出斜面外觀比較飽滿，菌液掛壁良好，鏡檢形態比較舒展的單菌共8株進行轉化試驗，結果可見表1。由表1可見通過菌種分篩試驗，在轉化時間相同的情況下，1號單菌與8號單菌轉化效率較高。

選取1號單菌進行不同轉化時間試驗，控制轉化18h、21h、24h檢測效價，結果可見表2。由表2可見轉化時間在21h時，轉化效率最高。

通過單菌篩選獲得優勢單菌1號和8號，通過對1號單菌轉化時間的考察，確定最佳轉化時間為21小時，從而提高了轉化效率。

參考文獻：

[1]陳由頁，曹國穎，傅得興，等.棘白霉素類抗真菌藥的研究進展[J].中國新藥雜志，2007，16（14）：1082-1087.

[2]葉麗娟，朱輝，田敏.微生物來源的真菌細胞壁抑制劑的研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊，2005，26（1）：34-41.

[3]蔣正立，林建群，陳文紅.棘白霉素類抗真菌藥的研究新進展[J].天津藥學，2005，17（5）：62-64.