維甲酸對異位內膜基質細胞Beclin-1的影響研究*

董少瑞,李紹波,路會俠△

(1.大理大學2013級臨床醫學專業，云南大理 671000;2.大理大學臨床醫學院，云南大理 671000)

子宮內膜異位癥(EMs)是育齡婦女常見病，其發病機制至今不明，有研究發現自噬(Autophagy)[1]可能與EMs的發生、發展密切相關[2]；而抑癌基因Beclin-1作為自噬過程重要的正向調控因子，參與自噬體形成[3-4]。維甲酸(RA)是天然維生素A的代謝產物，有研究顯示RA可能與子宮內膜細胞的激素調節有關，但RA對EMs的具體機制尚不清楚。本研究擬通過檢測不同劑量RA作用于正常子宮內膜基質細胞和異位內膜基質細胞(ESC)時Beclin-1表達的變化，探討RA治療EMs的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 選取20例EMs患者標本，年齡24～45歲，均已婚，月經規則，術前3個月未使用激素類藥物，均于2016年1-12月在大理大學第一附屬醫院行手術，術中剝離卵巢異位囊腫壁待用，病檢證實為EMs。另選同期20例因不孕癥行診刮術患者，年齡23～47歲，無激素治療，術后取子宮內膜待用，病檢證實為正常子宮內膜。本研究的所有患者均知情并簽字同意，且由醫院學術倫理委員會討論批準。所有標本在離體30 min內保存于液氮內，需要時分別取出解凍后行正常子宮內膜基質細胞或ESC培養，進行細胞試驗。

1.1.2主要試劑 Beclin-1多克隆抗體(美國Cell Signal公司)，微管結合蛋白輕鏈 3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ多克隆抗體(美國 Cell Signal 公司)，氯喹(CQ，美國 Selleckchem 公司)，兔抗人Beclin-1抗體(美國 Santa Ctuz 公司)，山羊抗兔二抗(聯科生物技術公司)，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(美國Jackson公司)，DAPI(美國Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 正常子宮內膜基質細胞或ESC均培養于37 ℃、5%CO2的細胞孵箱內，培養基為RPMI-1640(美國HyClone公司)+10% 新生牛血清(蘭州民海公司)，分為空白對照組(正常子宮內膜基質細胞)、CQ組(ESC)、CQ+RA組(ESC)，于對數生長期進行實驗。

1.2.2免疫熒光檢測 LC3是自噬標志物，最初位于細胞質，自噬形成時，胞質型LC3(LC3-Ⅱ)轉變為胞膜型LC3(LC3-Ⅱ)。LC3-Ⅱ在自噬體膜內外都有結合，檢測LC3熒光斑點是觀察細胞自噬最直觀的方法。兩種內膜基質細胞采用免疫熒光染色，觀察細胞內LC3熒光斑點。分別取正常子宮內膜基質細胞及ESC，接種在6孔板中，每個細胞設置3復孔，待48 h細胞融合時開始實驗。PBS洗滌3次，每孔加入固定液200 μL固定15 min。PBS洗滌3次，每孔加入細胞通透液200 μL(含0.1% Triton X-100的PBS)，室溫放置10 min。PBS洗滌3次，每孔加入封閉液200 μL，室溫濕盒內放置2 h。去除封閉液，每孔加入50 μL稀釋的一抗(Anti-LC3-Ⅱ抗體稀釋度 1∶2 000)。4 ℃冰箱濕盒內放置過夜。去除一抗，PBST洗滌3次。每孔加入50 μL熒光標記的二抗，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG稀釋度1∶400。37 ℃孵箱內孵育30 min(避光操作)。去除二抗，PBST洗滌3次。每孔加入100 μL DAPI(2 μg/mL)，室溫放置10 min。PBST充分洗滌3次。每孔加入200 μL PBS。倒置熒光顯微鏡觀察(避光操作)。

1.2.3RT-PCR 正常子宮內膜基質細胞和 ESC分別接種于6孔板中，待生長至大于80%時，空白對照組不做任何處理，CQ組加入CQ，CQ+RA組加入CQ和RA，藥物處理6 h后，用Trzol法(美國 Invitrogen 公司)進行總RNA提取(每100 g組織中)，1 μg mRNA用AMV反轉錄酶(美國Promage公司)合成cDNA。反應條件為預變性95 ℃ 30 s，變性94 ℃ 45 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，40個循環。GAPDH:上游引物5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-AGCC AAATTCGTTGTCATAC-3′；LC3-Ⅱ:上游引物5′-GACGGCTTCCTGTACATGGTTT-3′，下游引物5′-TGGAGTCTTACACAGCCATTGC-3′；Beclin-1:上游引物5′-GCTCCATGCTTTGGCCAATAAC-3′，下游引物5′-ATGGTCAAACTTGTTGTCCCAG-3′。

1.2.4Western blot 正常子宮內膜基質細胞和 ESC分別用不同濃度RA(5、10、20、40、60、80、100 μmol/L)和(或)CQ處理。取30 g細胞總蛋白經10%凝膠進行電泳分離，轉入PVDF膜，0.1% Tween 20(TBST；50 mmol/L Tris Cl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)和3% BSA封閉3 h，按稀釋濃度Beclin-1 1∶500加入一抗，4 ℃孵育過夜，按稀釋濃度1∶1 000加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入發光劑進行成像分析，觀察各實驗分組Beclin-1光密度差異。

1.2.5轉染Beclin-1 siRNA 實驗分為對照組、陰性對照組、轉染組及RA處理組，每組設3 復孔。轉染在24 孔板中進行，轉染前1 d 接種細胞，使得轉染時細胞融合達30%。轉染前1 h 將孔中培養基更換為無血清的RPMI-1640。24 孔板轉染分別用50 μL RPMI-1640稀釋20 pmol siRNA和1 μL Lipo 2000 Reagent，將100 μL復合物滴入細胞中，4 h 后換液，待細胞生長約80%融合時，熒光顯微鏡下觀察熒光及轉染情況。

1.2.6MTT 96孔板中分別培養ESC，待細胞生長為70%～90%時，加入RA(濃度分別為1、2、4、6、8 μmol/L)，同時設置調零孔(培養液、 MTT、 DMSO)，對照孔(培養液、MTT、DMSO)，每個樣品和對照均設3個平行樣，孵育24 h后，棄上清液，每孔加入90 μL含1%胎牛血清的RPMI-1640和10 μL的5 mg/mL MTT溶液，培養4 h棄上清液，每孔再加入110 μL的DMSO，置于37 ℃ 10 min至紫色結晶完全溶解后，利用酶標儀在490 nm測其吸光度值(A值)，計算出細胞存活率。

2 結 果

2.1正常子宮內膜基質細胞及ESC中LC3-Ⅱ的表達 正常子宮內膜基質細胞內僅個別細胞有少量的LC3熒光斑點，細胞維持低水平自噬。ESC中出現了明顯的LC3熒光斑點(自噬囊泡)，見圖1。

A:正常子宮內膜基質細胞;B:ESC

2.2RA對LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達的影響 CQ組LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達較空白對照組減少，而CQ+RA組較CQ組增加，差異有統計學意義(P<0.05)。CQ+RA組與空白對照組比較，Beclin-1 mRNA表達差異有統計學意義(P<0.05)，LC3-ⅡmRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 RA對ESC中LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達的影響

2.3不同濃度RA對ESC Beclin-1蛋白表達的影響 隨著RA濃度的增加，ESC Beclin-1蛋白表達逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 不同濃度RA作用下ESC Beclin-1蛋白表達變化

A：PCR；B：Western blot

2.4RA對siRNA Beclin-1的影響 siRNA Beclin-1在確定的轉染條件下可有效沉默ESC中Beclin-1 基因的表達，而RA可解除siRNA對Beclin-1的沉默作用，見圖4。

2.5RA細胞毒性 通過CQ或siRNA Beclin-1抑制自噬，不同濃度RA對細胞的存活率與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

A：CQ抑制；B：siRNA抑制

3 討 論

自噬是細胞的胞質降解并循環利用產生能量的過程。作為細胞“自我消化”的過程廣泛貫穿于真核細胞的諸多生命活動，并在多種疾病的病理過程中扮演重要的角色，尤其在腫瘤的發生、發展過程中起到了極為重要的作用。已有研究發現，與自噬相關的核心調控通路 PI3K/Akt/mTOR在包括乳腺癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤的研究中備受關注[5]。PI3K/Akt 通路激活 mTOR 表達調節細胞增殖，通過調節 缺氧誘導因子1-α(HIF-1)表達誘導 VEGF及胚胎干細胞產生，誘發血管形成和血管通透性增加[6-7]。新陳代謝、炎性反應、神經退行性病變等都會對細胞形成應激刺激，mTOR通路被抑制，使自噬能順利被誘導。自噬信號的激活可抑制腫瘤血管生成[6]。但自噬在EMs中的作用機制尚不十分清楚。Beclin-1 作為一種單倍體不足的腫瘤抑制基因，Beclin-1/PI3K-Ⅲ復合物參與了自噬體的形成及自噬的啟動[8]，Beclin-1的表達亦被用于檢測自噬的活性。Beclin-1下調或缺失可促使腫瘤細胞的惡性生物學效應，而上調其表達將成為某些特定腫瘤的有效治療手段[9]。Beclin-1在卵巢癌中的過表達可有效抑制 SKOV3/DDP 細胞的體外增殖能力及侵襲轉移能力[10]。不同臨床分期的EMs中Beclin-1表達不同，分期越高其表達越低[11-12]。REN等[13]報道Beclin-1在異位內膜中的表達遠低于在位內膜；HAMACHER-BRADY等[14]也發現EMs患者Beclin-1 mRNA 及蛋白表達低于健康女性。筆者在實驗中亦發現EMs患者Beclin-1 mRNA表達較健康人群減少，與文獻報道一致。

RA有著廣泛的生物學作用，如參與調節炎癥細胞、免疫細胞的激活，促進發育組織上皮細胞的增殖、分化等[15]。RA在人體細胞內的轉化受到嚴格的代謝通路調控，應用于治療某些細胞增殖性疾病(如白血病)和高VEGF表達的惡性腫瘤疾病。TEE等[16]發現RA對VEGF含量豐富的人早幼粒細胞(HL-60)內膜細胞效果明顯，主要通過Tie2信號途徑抑制血管內皮細胞及血管平滑肌細胞的生長。廖偉超等[17]報道依維莫司聯合RA能誘導NB4-R1細胞分化，且能阻滯細胞周期而不致細胞凋亡，其機制可能與依維莫司聯合RA抑制mTOR信號通路激活自噬作用有關。宋兆俠等[18]發現RA 可降低異位內膜組織中 VEGF mRNA和蛋白表達從而減少病灶內血管分布，減小內異癥病灶體積。本研究發現，RA與ESC一起孵育，可以刺激細胞中Beclin-1的表達，隨著RA濃度增加，Beclin-1的表達亦相應升高。利用自噬抑制劑CQ或轉染siRNA Beclin-1抑制EMs細胞的自噬后，發現RA可對抗自噬抑制劑CQ或基因沉默對Beclin-1的抑制作用。這些結果說明RA可以誘導自噬的發生，通過刺激ESC中Beclin-1的表達，而達到控制EMs病情進展的可能。

雖然近年國外已有研究表明PI3K/Akt/mTOR通路與EMs關系密切，但自噬在EMs異位灶形成過程中的作用是否與該通路有關，目前國內少見報道。RA可能通過激活自噬、抑制異位病灶中血管的生長而達到治療，其中機制有待進一步探索，有可能成為EMs的一種新的治療手段。