miR-216b通過FGFR1調節腎透明細胞癌細胞增殖和侵襲研究*

胡瓊丹，胡柯琴，樊均明,3△

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院腎內科，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學，四川瀘州 646000；3.成都醫學院，四川成都 610083)

腎癌是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤的3%左右，全球每年約9萬患者死于該腫瘤，其發病率呈上升趨勢[1-2]。成人腎腫瘤絕大多數是腎細胞癌，而其中70%～85%的患者為腎透明細胞癌[3]。目前，腎透明細胞癌的早期診斷和治療依然面臨著巨大的挑戰。大約30%的患者被發現時已經發生明顯的轉移，而常規的治療方法也僅僅是手術、放療和化療，上述原因導致緩解率僅有15%～25%，中位生存期小于12個月[4]。因此，進一步探索腎透明細胞癌的發病機制和治療手段顯得尤為緊迫。miRNA是一類豐富的非編碼RNAs(長度19～25 nt)，可以通過結合到靶基因的3′-untranslated regions (3′UTR) 來調節靶基因的轉錄，并在分化、發育、增殖、遷移和凋亡等進程中發揮重要作用[5-6]。越來越多的證據表明，miRNA與腎透明細胞癌的發生和發展關系密切。BUTZ等[7]研究表明，miR-124-3p在腎透明細胞癌中表達下調且與不良預后相關，并可以通過調節CAV1和FLOT1的表達調節腎透明細胞癌細胞的增殖、遷移,進而影響腎透明細胞癌的惡性進展。而miR-155在腎透明細胞癌中的表達明顯上調，并可以直接靶向E2F2來調節細胞的增殖和侵襲[8]。MüLLER等[9]通過高通量測序發現miR-216b在腎透明細胞癌組織中明顯低表達。但是miR-216b在腎透明細胞癌發生與發展中的作用還未見報道。本研究擬探討miR-216b在腎透明細胞癌細胞增殖和侵襲中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞系和主要試劑 293T、769-P、Caki-1和786-O細胞均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；RPMI1640和DMEM培養基均購自美國GIBCO公司；McCOY′s 5A培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清、TRIzol和Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自美國Promega公司；RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；miR-216b mimic購自上海吉瑪制藥技術有限公司；CCK-8、pcDNA3.1 FGFR1表達質粒、野生型和突變型FGFR1 3′UTR購自上海生博生物醫藥科技有限公司；Transwell小室購自美國BD Bioscience公司；增強型RIPA裂解液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和兔抗人FGFR1和GAPDH多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 769-P和786-O均在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中于37 ℃、20% CO2條件下進行培養。而293T和Caki-1則分別培養于DMEM和McCOY′s 5A培養基中。將處于對數生長期的Caki-1細胞消化后，在1 000 r/min條件下離心約5 min，隨后將細胞按50%的匯合度接種到6孔板中，待12 h后細胞完全貼壁，以100 nmol/L終濃度進行mimic NC和miR-216b mimic的轉染，同時添加10 μL Lipofectamine 2000；或者每孔分別轉染4 μg pcDNA3.1 (con)和pcDNA3.1 FGFR1表達質粒(FGFR1)，同時添加10 μL Lipofectamine 2000。

1.2.2qRT-PCR 將細胞中培養基去掉并利用PBS洗滌，收集細胞樣品，然后加入1 mL TRIzol，作用15 min后按照說明書提取總RNA。然后，通過反轉錄試劑盒在反轉錄引物作用下將提取的RNA反轉錄合成cDNA。最后，通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒利用miR-216b上下游引物來測定miR-216b的相對表達量。反應體系：Nuclease-free water 3.6 μL,2×SYBR Ex Taq mix 10 μL,ROX Ⅱ 0.4 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 5 μL,共計20 μL。反應條件：95 ℃條件下預變性5 min，然后95 ℃，變性5 s，60 ℃條件下34 s，共進行40個循環。采用2-△△Ct法進行數據處理，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3CCK-8實驗 收集轉染24 h后的Caki-1，按每孔5×104個細胞接種到96孔板中，并分別于1、2、3、4 d進行CCK-8檢測。檢測前每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后利用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.4Transwell實驗 收集轉染24 h后的Caki-1，在1 000 r/min條件下離心5 min，用新鮮培養基重懸，進行細胞計數，按每孔5×104個細胞接種于Transwell侵襲小室的上室，而在下室內加入含有10%胎牛血清的新鮮培養基，然后放置于細胞培養箱中繼續培養48 h，隨后取出小室，用棉簽將上室內細胞輕輕擦拭干凈，再用4%多聚甲醛進行細胞固定，用1%的結晶紫染色15 min，然后PBS洗3次，最后通過顯微鏡拍照進行細胞計數。

1.2.5Western blot 收集已經準備好的細胞，并于12 000 r/min條件下離心5 min，隨后加入預冷的RIPA裂解液進行細胞裂解，冰上作用30 min，在12 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒定量各組樣品的總蛋白濃度。通過煮沸將蛋白變性，每孔上樣50 μg，10%的SDS-PAGE凝膠進行蛋白分離，電泳完成后將蛋白轉PVDF膜上，轉膜完成后置于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，在4 ℃條件下孵育一抗(FGFR1 1∶300，GAPDH 1∶400)，通過TBST洗膜3次。隨后在37 ℃二抗孵育(1∶1 000)2 h，TBST洗膜3次，采用電化學發光法(ECL)進行顯影，通過Quantity One軟件進行灰度分析。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 通過Targetscan軟件預測到miR-216b可以結合到FGFR1 3′UTR，位置在第699～705，結合位點序列為5′-AGA GAU U-3′。將包含結合位點長度為1 000 bp的野生型和突變型FGFR1 3′UTR(wt-FGFR1和mut-FGFR1)構建到psi-CHECK2載體中。以50 nmol/L miRNA NC或miR-216b mimic和200 ng wt-FGFR1或mut-FGFR1質粒共轉24孔板中的Caki-1，并添加1.5 μL Lipofectamine 2000轉染試劑，轉染6 h后換液；轉染48 h后收集細胞進行裂解，并利用雙熒光素酶試劑盒進行分析。

2 結 果

2.1miR-216b在腎透明細胞癌細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示：miR-216b在293T、769-P、Caki-1和786-O的相對表達量分別為1.00±0.17、0.41±0.04、0.18±0.04、0.33±0.05。3株腫瘤細胞系中miR-216b的相對表達較正常人胚腎細胞明顯下調(P<0.01)，見圖1。

a:P<0.01,與293T細胞比較

2.2miR-216b對Caki-1細胞增殖和侵襲的影響 與NC組(1.00±0.14)相比，miR-216b組細胞中miR-216b的表達(14.01±2.73)明顯升高(P<0.01)。CCK-8實驗結果表明：與NC組相比，miR-216b組細胞在2、3、4 d的增殖能力均明顯降低(P<0.01)。Transwell小室實驗結果表明:與NC組相比，miR-216b組細胞的侵襲能力明顯降低(P<0.01)，見圖2。

A：qRT-PCR檢測miR-216b的表達；B：CCK-8實驗檢測miR-216b上調對Caki-1細胞增殖的影響；C、D:Transwell小室實驗檢測miR-216b上調對Caki-1細胞侵襲的影響；a:P<0.01，與NC組比較

2.3miR-216b對FGFR1的影響 通過Targetscan軟件預測發現，miR-216b在FGFR1 3′UTR有一個結合位點(圖3A)。Western blot顯示，293T、769-P、Caki-1和786-O的FGFR1蛋白相對表達量分別為0.18±0.04、0.28±0.03、0.77±0.09和0.54±0.07，正常人胚腎細胞FGFR1蛋白表達明顯低于腫瘤細胞(P<0.05)，且與miR-216b的表達趨勢相反(圖3B)。雙熒光素酶報告實驗結果表明：與wt-FGFR1+NC組細胞相比，wt-FGFR1+miR-216b組細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)；與mut-FGFR1+NC組細胞相比，mut-FGFR1+miR-216b組細胞熒光素酶活性沒有明顯變化(P>0.05),見圖3C。Western blot實驗結果表明：miR-216b上調可以明顯抑制Caki-1細胞FGFR1蛋白的表達(圖3D)。

A：miR-216b與FGFR1 3′UTR結合位點信息；B：FGFR1蛋白在4種細胞中的表達；C:miR-216b對野生型和突變型FGFR1 3′UTR熒光素酶活性的影響；D:miR-216b對Caki-1細胞中FGFR1蛋白表達的影響；a:P<0.05，與293T細胞比較

A:Caki-1細胞中FGFR1蛋白的表達；B:共轉miR-216b和FGFR1過表達質粒(FGFR1)后Caki-1細胞中FGFR1蛋白的表達；a:P<0.01,與con組比較

2.4FGFR1上調miR-216b對Caki-1細胞增殖和侵襲的影響 本研究通過構建FGFR1 CDS區表達質粒來實現FGFR1表達的恢復。結果表明：與對照表達質粒相比(con組)，FGFR1表達質粒轉染組(FGFR1組)Caki-1細胞FGFR1蛋白明顯上調(P<0.01)，見圖4A。FGFR1表達質粒能夠明顯逆轉miR-216b對Caki-1細胞FGFR1蛋白的抑制影響(P<0.01)，見圖4B。與miR-216b+con組細胞相比，miR-216b+FGFR1組細胞增殖能力明顯增強。Transwell實驗結果表明：miR-216b+con組和miR-216b+FGFR1組細胞的侵襲細胞數分別為(151±14)個和(377±24)個，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

A:CCK-8實驗檢測Caki-1細胞增殖；B:Transwell小室實驗檢測Caki-1細胞侵襲；a:P<0.01,與miR-216b+con組比較

3 討 論

據報道，miR-216b在多種腫瘤中低表達并發揮抑癌基因功能[10-15]。例如，DENG等[10]發現miR-216b在鼻咽癌細胞和組織中低表達，miR-216b上調明顯抑制鼻咽癌細胞生長和侵襲能力。LIU等[11]研究發現miR-216b在肝癌組織和細胞中低表達，miR-216b上調明顯抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移。在宮頸癌研究中，HE等[12]發現miR-216b在組織和細胞系中均低表達，miR-216b上調明顯抑制細胞增殖能力。在腎透明細胞癌中，MüLLER等[9]發現miR-216b呈現明顯的低表達。同時，筆者在本研究也發現miR-216b在腎透明細胞癌細胞系中的表達明顯低于正常人胚腎細胞。因此，推斷miR-216b在腎透明細胞癌也可能發揮抑癌基因作用。本研究發現miR-216b過表達可以明顯抑制Caki-1細胞增殖和侵襲能力，這與miR-216b在其他腫瘤中的研究結果一致，也進一步證明了miR-216b在腫瘤中往往發揮抑癌基因作用。

眾所周知，miRNAs可以通過直接靶向調控靶基因的表達來影響各種生理病理過程[16]。據報道，miR-216b在腫瘤中可以直接靶向TPT1、FOXM1、HDAC8等重要功能基因來調節腫瘤細胞的增殖和遷移[14-15,17]。FGFR1在腎細胞癌中高表達[18]。TSIMAFEYEU等[19]發現利用單克隆抗體抑制FGFR1的活性可以抑制Caki-1細胞增殖和內皮細胞遷移。同時，在胰腺癌中miR-216b可以通過靶向FGFR1來增強放療的敏感性[20]。本研究也發現FGFR1在腎透明細胞癌細胞系中的表達明顯高于正常人胚腎細胞，與miR-216b的表達趨勢相反。因此，筆者推測在腎透明細胞癌中，FGFR1可能是miR-216b潛在靶基因。本研究實驗結果表明：miR-216b可以抑制野生型FGFR1 3′UTR熒光素酶活性，但不影響結合位點突變的FGFR1 3′UTR熒光素酶活性。同時，miR-216b上調可以明顯抑制Caki-1細胞FGFR1蛋白的表達。上述結果表明在腎透明細胞癌細胞中FGFR1確實是miR-216b的靶基因。但是，據此斷定FGFR1是miR-216b的功能靶還缺乏扎實的理論依據。因此，本研究通過FGFR1表達載體來恢復miR-216b導致的Caki-1細胞中FGFR1表達下調。本研究結果表明：FGFR1過表達可以逆轉miR-216b上調對Caki-1細胞增殖和侵襲的抑制作用。這表明miR-216b對Caki-1細胞增殖和侵襲的影響是通過抑制FGFR1的表達來實現的。

綜上所述，本研究表明miR-216b可以通過直接抑制FGFR1的表達來抑制腎透明細胞癌的增殖和侵襲，為腎透明細胞癌的治療提供了新的潛在作用靶點。