惡臭假單胞菌的采集及菌種鑒定分析

韓金鑫

(天津冶金職業技術學院，天津 300400)

碳酸鹽巖在自然界中廣泛分布，在碳酸鹽巖的表面具有多種多樣的微生物存在[1]，微生物的新陳代謝及生命活動對碳酸鹽巖的風化、表面形貌及周邊環境都有重要影響。白云巖作為典型的碳酸鹽巖，其表面分布著多種重要的微生物[2]。微生物的生長繁殖及其代謝活動不僅可以加速巖石礦物的風化，還可以促進或誘導礦物的合成[3]。惡臭假單胞菌作為白云巖表面的優勢菌株對其具有重要的礦化作用[4]。

近年來，隨著分子生物學研究技術在微生物生態學研究中的廣泛應用，依賴于DNA的系統發育的多樣性研究已經成為微生物多樣性研究的重要代表[5]。微生物種類繁多，各種微生物具有各自獨特的酶系統，因而對底物的分解能力不同，其代謝產物也不同。用生物化學方法測定這些代謝產物，可用來區別和鑒定細菌的種類[6]。利用生物化學方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生物化學試驗或稱生化反應。生理生化實驗的方法很多，本文主要研究對該菌株具有判斷影響的幾種實驗。本文選用分離自白云巖表面的惡臭假單胞菌作為實驗菌株。將其編號為DCB13菌株。

1 材料與方法

1.1 惡臭假單胞菌的采集

白云巖樣品采集自貴州省貴陽市云巖區阿哈水庫旁，選擇表面微生物豐富的白云巖礦物，以地質錘鑿取巖石礦物，除去污染部分后收集在無菌袋中保存。

在實驗室中用無菌水清洗數次，刮取表面微生物在牛肉膏蛋白胨固體培養基中生長數天，待其大量繁殖后，挑取生長旺盛的疑似惡臭假單胞菌的單菌落，經過數次純化培養后待用，將其編號為DCB13菌株。

1.2 生理生化實驗

根據伯杰細菌手冊[7]、常見細菌系統鑒定手冊[8]、一般細菌常用鑒定方法及環境微生物實驗技術[9]等，對DCB13菌株進行生理生化實驗鑒定。

主要實驗包括：(1)氧化酶實驗；(2)過氧化氫酶實驗；(3)淀粉水解實驗；(4)吲哚實驗；(5)甲基紅實驗(M.R.實驗)；(6)乙酰甲基甲醇實驗(V-P實驗)；(7)利用檸檬酸鹽實驗；(8)產H2S實驗；(9)硝酸鹽還原實驗；(10)葡萄糖氧化發酵實驗。

1.3 DNA測序實驗

1.3.1 DNA提取

參照分子生物學實驗指南的方法[10]，提取基因組DNA。

1.3.2 16S rDNA的PCR擴增反應

選用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)、引物T7 promotor (5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)及引物SP6 promotor(5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)。

PCR反應體系：10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.5 μL，dNTPMixture(各 2.5 mmol/L) 4?L，27F(10 μmol/L) 2μL，1492R(10 μmol/L) 2μL，模板DNA 1μL，用滅菌雙蒸水補足至50μL。

PCR反應條件：先94 ℃ 5min，再94 ℃ 1min、52 ℃ 1min和72 ℃ 2min，30個循環，最后72 ℃延伸10min。

取PCR產物5.0 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果。

1.3.3 DNA測序

測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

2 結果與討論

2.1 生理生化實驗結果

氧化酶實驗中在培養基中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，菌苔8s呈紅色，測試結果為陽性(+)；過氧化氫酶實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，滴加H2O2有氣泡產生，測試結果為陽性(+)；淀粉水解實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，菌苔周圍無透明圈出現，測試結果為陰性(-)；吲哚實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，溶液呈紅色，測試結果為陽性(+)；甲基紅實驗(M.R.實驗)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，溶液呈無色，測試結果為陰性(-)；乙酰甲基甲醇實驗(V-P實驗)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，培養液不呈紅色，測試結果為陰性(-)；利用檸檬酸鹽實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌種，培養基顏色變為藍色，測試結果為陽性(+)；產H2S實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，使濾紙條不變黑，測試結果為陰性(-)；葡萄糖氧化發酵實驗中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，試管中顏色由上向下變色，屬氧化型。

2.2 DNA測序實驗結果

用引物擴增DCB13的16S rRNA基因，基因片段如下：

確定該DCB13菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，其GenBank登陸序列號JN650551。

3 結論

(1)通過對白云巖表面微生物的采集、培養、純化可得到惡臭假單胞菌。

(2)對該菌株進行氧化酶實驗、過氧化氫酶實驗、淀粉水解實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗(M.R.實驗)、乙酰甲基甲醇實驗(V-P實驗)、利用檸檬酸鹽實驗、產H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖氧化發酵實驗，根據實驗結果可初步判斷該菌株為惡臭假單胞菌。

(3)通過對該菌株進行DNA測序，確定該菌株為惡臭假單胞菌。

(4)通過生理生化實驗可對未知菌株進行初步判斷，為后續實驗提供依據和幫助。

(5)在白云巖表面存在著惡臭假單胞菌等優勢菌株，他們的繁殖和代謝活動會對碳酸鹽巖的風化和表面形貌的形成產生重要作用。