水產品中孔雀石綠快速檢測產品質量評估

苑婷婷，儲成群，肖毅美，黃彬昌，李金燕

(深圳凱吉星農產品檢測認證有限公司，廣東 深圳 518000)

孔雀石綠( MG)為三苯甲烷類染料，曾被廣泛用于預防和治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[1]，亦會為了延長磷受損魚的生命用在運輸過程或存放池內等流通環節。但因其均具有潛在的致癌、致畸、致突變等副作用，嚴重威脅著消費者的身體健康[2-3]。世界上許多國家已將孔雀石綠列為水產養殖禁用藥物，中國于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農業部第193號公告)。由于孔雀石綠的藥物治療效果好且價格低廉，在水產養殖、流通中仍有部分養殖戶違法使用，是目前造成孔雀石綠在水產中檢出率居高不下的原因之一。

目前孔雀石綠主流檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)，檢出低限分別為0.5μg/kg和2.0μg/kg，日本和香港對孔雀石綠的不合格判定標準為2.0μg/kg。該技術除需配備昂貴的大型儀器和大量輔助實驗設備外，前處理方法過于繁雜耗時，無法應對水產品質量監管發展需求。而發展較成熟免疫膠體金快速檢測技術因具有簡便快速等優點，被廣泛用于對產地和流通市場的樣品進行常規篩選檢測[4]，卻也常被質疑有如前處理復雜、假陽性率偏高、檢測靈敏度低等技術短板。

為客觀地分析和評價當前國內市場上此類(水產品孔雀石綠)免疫膠體金快速檢測試劑盒產品的質量狀況，課題組選取5款主流的國產市售的可用于現場檢測水產品中孔雀石綠殘留的免疫膠體金快速檢測產品(簡稱孔雀石綠快檢試劑盒)進行調研，通過實驗驗證其靈敏度、穩定性、實際樣品檢出符合率等技術指標，為從事水產品中藥物殘留監管的工作人員、水產品養殖和加工企業、農批市場等流通領域應用此類產品提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

表1 5款孔雀石綠快速檢測產品外觀及標示情況比較

根據水產品孔雀石綠現場快速檢測的適用性需求，課題組基于檢測低限2.0μg/kg、無需大型的檢測儀器、單個樣品檢測2 h內完成原則，篩選具有代表性的五家主流公司的產品進行比較研究，為避免影響公司的經營情況，本文將用A、B、C、D、E分別表示5款孔雀石綠快檢試劑盒，其基本情況見表 1。

1.2 試劑與設備

孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其同位素內標標準品(純度≥95%，Dr.E)；乙腈、甲醇均為色譜純(J.T.Baker)，二氯甲烷、無水乙酸銨、冰乙酸等試劑均為分析純(上海國藥集團)。液相色譜-串聯質譜儀(美國 AB 5500)、電子分析天平(Sartorius BT25S-CW)。

1.3 試驗方法

1.3.1 空白基質樣品制備

選取不含孔雀石綠、隱性孔雀石綠殘留的草魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉。樣品均質混勻，18 ℃以下冷凍保存備用。

1.3.2 孔雀石綠快檢試劑盒的評判

采用各產品說明書中提供的檢測方法進行檢測，試驗中采用空白草魚樣品中對各產品進行靈敏度、重復性、準確性等加標試驗，依據GB/T 19857-2005《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》方法對快檢陽性樣品進行符合性驗證。

1.3.2.1 靈敏度試驗

采用空白草魚樣品對標稱檢測限、2倍標稱檢測限、4倍檢測限和10倍檢測限進行加標試驗，分別添加有孔雀石綠和隱性孔雀石綠標樣，每個濃度做三次平行，并與空白樣品進行對照。

1.3.2.2 重復性試驗

各試劑盒提供的產品在靈敏度試驗時不一致，故根據各試劑盒的實際靈敏度進行重復性試驗。采用空白草魚樣品添加無色孔雀石綠標樣，按照說明書的操作步驟，用同一產品在同一時間測定3個檢測試劑卡，判定產品的重復性。

1.3.2.3 對比性試驗

為了進一步驗證試劑的準確性，聯系廠家技術人員現場對比試驗，分別同時做10個不同濃度盲樣。

1.3.2.4 確性試驗

為了驗證試劑的準確性，選取15 批次孔雀石綠快檢試劑盒判定為陽性樣品進行上液質定量驗證其準確性情況。

1.3.2.5 結果判讀

檢測結果為陰性、陽性和可疑結果(臨界區間)3種,檢測人員依照各孔雀石綠快檢試劑盒說明書中描述的“結果判讀原則”判定,并進行結果讀取和記錄。根據最終結果計算各孔雀石綠快檢試劑盒的檢出符合率。

2 結果與分析

2.1 靈敏度

按照各孔雀石綠快檢試劑盒提供的說明書的操作步驟，以靈敏度試驗方法進行試驗，按各試劑盒給定的判定方法進行結果判定，在三個平行樣品必須一致，試驗結果如表2。

表2 孔雀石綠試劑盒靈敏度試驗結果

注：“-”為陰性，未檢出；“+”為陽性，能進行判定，有檢出；“+/-”因顏色顯現不明顯，定義為臨界區間可疑結果。

靈敏度方面，D、E試劑盒基本滿足(隱性)孔雀石綠檢測低限為2.0 μg/kg，但D試劑盒與標稱檢測低限1.0 μg/kg不符；而C試劑盒隱性孔雀石綠檢測低限無法達到2.0 μg/kg，與標稱不符；A、B試劑盒靈敏度驗證存在較大偏差，檢測低限在10.0μg/kg，與標稱嚴重不符。

2.2 穩定性

由于各試劑盒檢出限不同，將準確性試驗中的檢出限結果作為重復性試驗的濃度，采用空白草魚樣品添加隱形孔雀石綠標樣至相應的濃度，按照說明書的操作步驟用同一批次產品在同一時間測定3個樣品，按照要求判定檢測結果，具體如表3。

注： “-”為陰性，未檢出； “+”為陽性，能進行判定，有檢出， “+/-”因顏色顯現不明顯，定義為臨界區間可疑結果。

穩定性方面，除A試劑盒穩定性較差外，其余4款試劑盒均表現良好。

2.3 對比性

為更客觀真實體現試劑盒技術性能，故從取樣到結果判定均由各試劑盒廠家技術人員獨立開展。鑒于A、B兩款試劑盒在加標濃度為5.0μg/kg情況下無法準確辨識，故不參與對比性試驗。其余結果如表4。

表4 孔雀石綠試劑盒符合性試驗結果

注： “-”為陰性，未檢出； “+”為陽性，能進行判定，有檢出； “+/-”因顏色顯現不明顯，定義為臨界區間可疑結果。

由上述試驗結果可知，3款試劑盒最多達到50%概率的符合性。而E試劑盒的假陽性率明顯高于另外兩家。

2.4 準確性

隨機篩選15批次已知定量檢測結果的樣品，分別應用這5款試劑盒進行驗證，進一步對其準確性及符合率進行評估，結果如表5所示。

表5 快檢陽性樣品定量檢出符合率統計結果

注：“符合”代表快檢結果與定量結果一致， “不符合”代表快檢結果與定量結果不一致。

2.5 評價分析

通過從靈敏度、重復性、對比性、準確性四方面對這5款孔雀石綠快速檢測試劑盒技術性能進行判定，匯總結果見表6。

表6 5款孔雀石綠試劑盒性能分析對比

注：“符合率”= 定量陽性數/快檢陽性數*100%。

通過從最低檢出限、檢測時間、檢出率和符合率系列數據進行測評，5款試劑盒均具有操作步驟相對簡單，試劑種類精簡，便于檢測人員掌握等優勢。但有3款靈敏度及定量結果符合性整體評價較差，D、E兩款試劑盒技術性能勉強符合現場檢測要求。在實驗過程中發現存在一定比例的假陽性、假陰性結果，在目標物含量偏低時，其陽性結果顯示存在一定的誤差，不易辨別。推測其可能原因是試劑本身含有的抗原或抗體特異性較差，易受生物體其他成分干擾形成假陽性或假陰性結果。

3 討論

作為水產品質量安全重點監控的孔雀石綠項目，其快速檢測試劑盒已成為一種現場快速檢測的監管手段。而其質量將直接影響監管的權威性和有效性[5]。劉歡等[6]曾對10種孔雀石綠快檢產品進行比較研究，有7種產品的檢測性能與其自身商標標識不符，產品不達標。錢蓓蕾等[7]曾對3種孔雀石綠快速檢測試劑盒進行比較研究，結果顯示有2種產品的檢測限沒有達到產品標識要求。伏慧明等[8]發現應用快速檢測試劑盒類產品得出的檢測結果往往與試劑盒所標示的各項技術指標相差甚遠，出現假陽性的幾率很大，嚴重影響檢測方法的運用和結果的判定，如在實際監管中應用該產品進行檢測，將可能檢出大量的假陽性樣品，增加監管部門使用儀器驗證檢測結果的負擔,影響監管效率。依據文中試驗情況分析，說明大部分基于免疫膠體金技術開發的孔雀石綠快檢產品的靈敏度還不能達到準確定性、精確定量。孔雀石綠快速檢測試劑盒市場確實存在相對混亂，產品質量良莠不齊的現象。建議在應用免疫膠體金類快速檢測試劑盒進行水產品孔雀石綠殘留檢測前,有必要對試劑盒所標示的各項技術指標(如靈敏度、重復性、對比性、準確性等)進行逐一地驗證，從而正確評估試劑盒技術性能及應用風險。