β-CD包絡肽的介孔硅納米塞的構建與控釋性能研究

梅顯斌，阮麗萍

(四川大學 化學工程學院，四川 成都 610065)

近年來，為減輕化療對癌癥患者的毒副作用[1-2]，研究者們開發了多種藥物控釋系統[3-4]，介孔硅因其獨特優勢而成為理想的藥物控釋載體[5-6]。谷胱甘肽(GSH)具備較強的還原性，很容易切斷二硫鍵。研究表明，人類癌細胞內GSH的常見濃度為10 mmol/L，顯著高于其在細胞外的濃度(2～10μmol/L)[3-7]。這種明顯的差異性為氧化還原刺激響應體系的構建提供了必要的條件，研究者們已經設計出了多種基于GSH還原二硫鍵而實現藥物控釋的控釋系統，但這些控釋系統多采用高分子聚合物作為封堵分子，雖效果良好但其合成復雜[8-10]。

多肽是人體內普遍存在的一類非常重要的生物活性物質，多肽具有生物相容性好，易生物降解，降解產物對機體無二次傷害等優點[11]，因此是一種理想的閥門分子，目前已報道的基于肽的控釋閥門多是利用長鏈肽的自組裝實現封堵，其合成也較為復雜。因此，本文擬在MCM-41型介孔硅上修飾二硫鍵，在二硫鍵另一端修飾只有兩個氨基酸的二肽，末端氨基酸為含有疏水吲哚結構的色氨酸，并以二肽為“錨點”，通過β-CD的內部疏水空腔包絡肽形成“納米塞”實現對孔道的封堵。

1 實驗部分

1.1 二肽修飾的介孔硅的制備

首先，按照文獻[12]報道的方法略微調整后制備了MCM-41型介孔硅，巰基(-SH)修飾的介孔硅MCM41-SH 以及半胱氨酸(Cys)修飾的介孔硅MCM41-S-S-Cys。接著進一步與色氨酸(Trp)反應制得二肽修飾的介孔硅納米顆粒MCM41-S-S-Cys-Trp，具體方法如下：在燒瓶里將40 mg 色氨酸(Trp)分散在2 mL 的MES 緩沖液(pH值=6.0,0.1mol/L)中，然后加入適量的DMSO使色氨酸溶解，再加入40 mg的EDC.HCl和20 mg的SULFO-NHS，室溫下攪拌30min。40mg的MCM41-S-S-Cys分散于2 mL 的pH值=7.4的PBS緩沖液，然后將分散液加入到燒瓶中，室溫下攪拌過夜。反應結束后，將溶液高速離心(10000 r/min，15min)，分離出顆粒，然后用去離子水洗滌顆粒3次，得到二肽修飾的介孔硅MCM41-S-S-Cys-Trp。

1.2 納米顆粒(MCM41-S-S-Cys-Trp)負載亞甲基藍實驗

實驗采用亞甲基藍(MB)作為模擬藥物。取濃度為1×10-3mol/L的MB水溶液750μL與10 mg的納米顆粒混合均勻，然后放在50℃水浴中加熱2 h后關加熱，常溫下過夜。次日取5 mg 負載MB的納米顆粒，加入5 mg β-CD后繼續攪拌10 h，之后用去離子水洗4次。最后一次洗滌后，用200μL水溶解納米顆粒，然后裝到截留分子量為14kDa的半透膜里，將其放入25 mL 燒瓶后加入15 mL去離子水緩慢磁力攪拌，每天換3次水，洗2天，最后一次換水后加15 mL水過夜。

1.3 載藥納米顆粒的體外釋放實驗

先取3 mL燒瓶內液體測量吸光度，每隔10min取一個點，測量完吸光度后馬上倒入燒瓶內，取6個點，完成后加入稱量好的GSH粉末(溶液中GSH濃度為10 mmol/L)，然后每10min取釋放液測試吸光度，測量完盡快倒回體系中，連續測量4 h。最后通過作標準曲線將吸光度值換算成濃度值。

1.4 材料結構表征

高分辨透射電子顯微鏡(TEM 為JEM-2100Plus 型)；N2吸附-脫附實驗采用全自動比表面積及孔隙分析儀(Micromeritics-TristarII3020 型)，樣品在110 ℃下脫氣12 h 后在77K下進行實驗，數據采用BET-BJH 方法計算比表面積和孔徑；Zeta 電位采用納米粒度電位分析儀(Zetasizer Nano 型)；熱失重分析儀(TGA): HCT-2 型，升溫速率10℃/min，載氣為氮氣，測量溫度范圍為100～700℃；吸光度用UV-1800PC紫外/可見分光光度計測量。

2 結果與討論

2.1 表面肽修飾后的介孔硅納米顆粒的形貌分析

圖1 MCM41-S-S-Cys-Trp的TEM照片

采用高倍率透射電子顯微鏡(TEM)對制備的介孔硅納米顆粒MCM41-S-S-Cys-Trp形貌進行了觀察。從圖1可以看到，MCM41-S-S-Cys-Trp為橢球形粒子，表面有明顯的介孔，粒子尺寸大小為110nm左右。顆粒之間有部分交聯的現象，這可能是由于介孔硅表面修飾的肽之間存在正負電荷的吸引力和苯環之間的疏水作用引起的，可見介孔硅納米顆粒在修飾多肽后并未對介孔結構造成影響。

2.2 介孔硅納米顆粒表面修飾基團的結構鑒定

在圖2中可見，MCM-41在修飾不同基團前后，對應的紅外譜圖都出現了不同的峰位變化，但是作為本體的MCM-41特征峰沒有發生很大變化。在波數3000～3700 cm-1之間，都存在著一個較寬的吸收峰，這是硅羥基(Si-OH)的伸縮振動峰。由于修飾巰基后MCM-41表面形成Si-O-Si鍵，使得硅羥基數量減少，所以在波數為3000～3700 cm-1之間的吸收峰強度不高；在波數1081 cm-1附近的一個相對較寬又較尖銳的吸收峰，應是MCM-41內、外表面上的硅氧四面體(SiO4)反對稱伸縮振動峰；波數在500～1000 cm-1之間的幾個吸收峰，歸屬于硅氧四面體的骨架振動譜帶。以上結果說明在對MCM-41改性的過程中并沒有破壞其主體結構。從圖2(a)可知，將巰基(-SH)接枝到二氧化硅表面后，其FTIR光譜顯示出1450 cm-1和2935 cm-1的新譜帶，這分別屬于-CH2-中的C-H伸縮振動和C-H不對稱彎曲振動特征峰。此外，在2565 cm-1處出現了巰基吸收帶，這更是直接表明了巰基(-SH)修飾成功。從圖2(b)中FTIR譜圖可見，2565 cm-1處的巰基吸收峰消失，而在1584 cm-1和1564cm-1處出現兩個新的峰，這歸屬于芳環(骨架譜帶)的伸縮振動，并且2930 cm-1處的峰表明-CH2- 的存在，這表明顆粒上存在吡啶環，說明MCM41-S-S-pridine制備成功。如圖2(c)FTIR譜圖所示，MCM41-S-S-Cys中，1584 cm-1和1564 cm-1處的兩條譜帶消失。與此同時，在1340 cm-1處出現了新譜帶，這屬于C-N伸縮振動，在1749 cm-1處的新譜帶屬于羰基中的C=O，這說明Cys接枝成功。從圖2(d)中可見，在修飾色氨酸后出現了幾個新的譜帶。在1770 cm-1處出現的譜帶屬于羰基中的C=O伸縮振動，1650 cm-1處的新譜帶屬于N-H不對稱彎曲震動峰，此外，在1458 cm-1和1525 cm-1處有兩個新的譜帶是由苯環中的C=C骨架振動引起的，這說明MCM41-S-S-Cys與色氨酸的酰化反應成功，制得MCM41-S-S-Cys-Trp納米粒子。

(a)脫模后MCM41-SH，(b)MCM41-S-S-pridine，(c)MCM41-S-S-Cys，(d)MCM41-S-S-Cys-Trp

圖2 紅外光譜

Fig.2 FT-IR spectra

2.3 表面修飾不同基團后的介孔硅納米顆粒的Zeta電位

從表1和圖3中可以看出，修飾了巰基的MCM41-SH顯負電，其Zeta 電位值為-24.2 mV，這是因為巰基(-SH)在水中帶負電。而帶有吡啶環的MCM41-S-S-pridine的電負性增大至-26.8 mV，這是由于吡啶環上的氮原子的電負性較大所致。MCM41-S-S-Cys 納米粒電負性降低至-22.2 mV，這是因為修飾的半胱氨酸含有氨基和羧基，其等電點為5.05，因此，MCM41-S-S-Cys 納米粒在水溶液中表現為帶負電。而與MCM41-S-S-pridine相比，MCM41-S-S-Cys 納米粒缺少了帶負電的吡啶環和增加了帶正電的氨基，因此，其電負性降低。進一步修飾了色氨酸的MCM41-S-S-Cys-Trp電位值較MCM41-S-S-Cys變化不大，這是因為原來的半胱氨酸與新引入的色氨酸均含有氨基和羧基，兩種氨基酸之間會發生酰胺化反應形成酰胺鍵，反應后體系仍然存在相當數量的氨基和羧基，MCM41-S-S-Cys-Trp帶電荷的基團變化不大，因此，二者電位值變化也很小。

表1 介孔硅納米粒子接枝化學基團后的Zeta 電位值

圖3 介孔硅納米粒子接枝不同基團后的Zeta電位變化趨勢

Fig.3 The trend of Zeta-potential of MSNs after grafting with chemicals at each step

2.4 脫模后介孔硅納米顆粒的介孔性質表征

通過N2吸附-脫附法對脫模后的介孔硅納米粒MCM41-SH的比表面積、孔容積和孔徑大小及分布情況進行測定，相關數據見表2，吸附-脫附曲線及孔徑分布圖見圖4。從圖4中可見，該吸附平衡等溫曲線屬IUPAC分類中的IV型，H1滯后環，與典型的MCM41型介孔材料相同。納米顆粒在低壓段吸附量平緩增加，此時N2分子經歷了從單層到多層吸附在介孔的內表面，隨著相對壓力P/P0的不斷增加，N2的吸附量也在增加。MCM41-SH在相對壓力P/P0在0.3～0.4之間吸附曲線與脫附曲線出現比較明顯的突躍且兩條曲線距離很窄，表明含有介孔結構，且孔的均一性很好，這也與圖中的孔徑分布相一致，說明改性后的納米顆粒介孔結構仍然存在。通過計算，MCM41-SH的比表面積高達1051.8 m2/g，BJH孔容積為1.00 cm3/g，孔徑分布較窄，平均孔徑為3.4 nm。

表2 MCM41-SH介孔硅納米粒子的比表面積、孔容積和孔徑值

圖4 MCM41-SH納米粒子的N2吸附-脫附等溫曲線和BJH孔徑分布

Fig.4 Nitrogen adsorption and desorption isotherms and pore size distribution of samples MCM41-SH

2.5 表面修飾后的介孔硅納米顆粒的TG分析

圖5 MCM41-SH,MCM41-S-S-pridine,MCM41-S-S-Cys 和MCM41-S-S-Cys-Trp的熱重曲線

從圖5可見，巰基修飾的MCM41-SH在測試區間的失重為11.2%，這主要是因為在介孔硅表面的帶巰基的硅烷偶聯劑因高溫失重而引起的。對MCM41-S-S-pridine而言，其在測試區間的失重增加至15.9%，這與其結構增加了硫和吡啶，有機物含量增加有關。從圖5可看出，MCM41-S-S-Cys在測試區間的失重進一步增加至19.3%，這是因為修飾半胱氨酸后，納米粒子中的有機物比重增加，當溫度上升后有機物失重，造成失重增加。MCM41-S-S-Cys-Trp在測試區間的失重量均高于前面三種納米粒，失重量增加至22.1%，這是因為在MCM41-S-S-Cys上接枝了色氨酸，納米粒子的有機物比重進一步增加，從而引起測試區間的失重值進一步增加。熱失重分析的結果說明了我們在對介孔硅改性的過程中，每一步反應均取得成功。

2.6 介孔硅納米藥物控釋系統釋放藥物的定量分析

亞甲基藍(MB)具有水溶性好，理化性質穩定，不易水解，便于檢測等優點，其直徑約為1.1～1.2 nm，在水溶液中帶正電荷，是理想的模擬藥物。以1 mmol/LMB載藥的控釋系統記為MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD，并測定了該控釋系統在無GSH和在10 mmol/L GSH刺激下在不同時間點的釋放，結果如圖6所示。

在圖6中0～60min 內的5個點屬于無GSH環境下的平衡數據，是該藥物控釋系統在純水中浸泡12 h后的累計洗出量，并且在測量的1 h內其濃度值沒有明顯變化，說明“納米塞”能有效的將MB封堵在孔道內，幾乎無泄漏。當在第60min時，加入GSH使控釋體系環境中的GSH濃度達到10 mmol/L后，釋放液中的MB濃度值明顯升高，第70min時的濃度值以達無GSH時的6倍，此后，隨著藥物不斷地從孔道內釋放出來，體系中的MB濃度值繼續升高。在第240min以后，釋放曲線趨于平緩，說明控釋系統中MB的釋放接近結束，最終在第300min時MB濃度值到達最初的22倍之多。以上結果說明GSH促使控釋系統MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD實現藥物釋放，結合其控釋機理，只有封堵孔口的“納米塞”被移除后，孔道內的MB才能快速釋放出來。由此可以說明，在介孔硅納米藥物控釋系統MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD中，β-CD與二肽形成的“塞納米塞”能有效封堵孔口，而當體系中存在10 mmol/L GSH時，連接肽的二硫鍵被打斷，使得肽和β-CD一同脫離介孔硅表面，孔口被打開，孔道內的MB得以釋放出來，實現了對藥物的可控釋放。

圖6 納米藥物控釋系統MB@MCM41-S-S-Cys-Trp@β-CD的釋放曲線

3 結論

在MCM-41型介孔硅表面修飾了對GSH響應的二硫鍵及生物相容性優良的二肽小分子。以亞甲基藍為模擬藥物進行控釋實驗，以β-CD包絡二肽的“納米塞”在無GSH刺激時能保持良好的封堵能力，無亞甲基藍釋放，而當在10mmol/L GSH刺激下，能快速釋放負載的大量亞甲基藍，釋放量為無GSH刺激的22倍。以上結果表明“納米塞”具有良好的控制-釋放性能，在藥物控釋方面具有應用潛力。