microRNA194過表達抑制荷瘤小鼠肝癌細胞生長的實驗研究*

楊學民，李朝路，李兆陽

本研究通過構建microRNA194過表達的肝癌細胞，在體外細胞學和動物體內觀察了microRNA194對肝癌細胞增殖的影響，同時初步探討了microRNA194發(fā)揮作用的下游靶基因情況。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞Hep3B培養(yǎng) Hep3B細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）。待細胞生長至對數(shù)生長期（融合度為70%～80%）時，行細胞傳代和轉染等后續(xù)實驗。

1.2 microRNA194模擬物的合成 合成microRNA194模擬物（microRNA194 mimics）和陰性對照（control）序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司完成（表1）。

表1 microRNA194模擬物和陰性對照序列

1.3 過表達microRNA194肝癌細胞Hep3B構建按照LipofectamineTM 2000轉染液（Invitrogen公司）說明書進行細胞轉染，具體步驟，1，細胞準備：轉染前24 h，將合適數(shù)量的Hep3B細胞接種于96孔板，加入用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μl/孔培養(yǎng)，使細胞融合度達到50%～70%；2，轉染液的配制：A液：每孔microRNA194模擬物和陰性對照各4 pmol，溶于不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）25 μl；B 液：每孔 0.2 μl的LipofectamineTM 2000轉染液溶于不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基25 μl，靜置5 min。將A液與B液混勻，每孔共50 μl，靜置20 min，以利于充分形成轉染復合物；3，吸棄96孔板上清培養(yǎng)液，PBS洗滌，每孔加入不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基50 μl，隨后加入第2步中配制的轉染液（50 μl/孔），將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。然后，將培養(yǎng)上清液吸棄，加入新鮮配置的含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；4，采用熒光定量PCR法檢測microRNA194 mRNA水平，驗證是否成功構建過表達microRNA194的肝癌細胞Hep3B，檢測microRNA194的引物序列見表2，由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 熒光定量PCR反應引物序列

1.4 過表達microRNA194荷瘤小鼠的構建 取30只健康清潔級Balb/c裸鼠（4周齡，15～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司）。采用隨機數(shù)字表法隨機分配為microRNA194過表達組15只和對照組15只。使用1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，使用75%酒精對腋下皮膚進行局部消毒，使用1 ml注射器吸取Hep3B細胞懸液200 μl（2×106）皮下接種，分別使用microRNA194模擬物轉染的Hep3B細胞或用陰性對照序列轉染的Hep3B細胞。

1.5 腫瘤體積和質量監(jiān)測 在接種Hep3B細胞后，每隔5 d，使用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，按照公式（體積=0.52×長×寬2）計算腫瘤體積。在接種細胞后21 d，將Balb/c裸鼠處死，小心分離腫瘤，稱質量后將腫瘤組織保存于-80℃。

1.6 腫瘤組織microRNA194和IGF1R mRNA水平檢測 采用熒光定量PCR法檢測，microRNA194和胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）mRNA的引物序列參照文獻進行合成[1]（表2，上海生工生物工程有限公司）。依次進行組織mRNA提取、逆轉錄合成cDNA和熒光定量PCR檢測，將對照組microRNA194和IGF1R mRNA水平設定為 1，與microRNA194過表達組進行比較。

1.7 腫瘤組織IGF1R蛋白表達檢測 采用Western blot法，使用抗IGF1R抗體和抗內參GAPDH蛋白抗體（Abcam公司）檢測，使用Image Pro Plus 6.0軟件分析IGF1R蛋白與內參GAPDH蛋白條帶的灰度值，IGF1R蛋白與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值即為IGF1R蛋白的相對含量。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。當P＜0.05時，代表具有統(tǒng)計學差異，以*表示；當P＜0.01時，代表具有顯著性統(tǒng)計學差異，以**表示。

2 結果

2.1 兩組細胞microRNA194 mRNA水平比較 結果顯示，轉染microRNA194模擬物的過表達組與對照組相比，microRNA194 mRNA水平顯著升高（P＜0.01，圖1），表明我們成功構建了過表達microRNA194的肝癌細胞。

圖1 兩組細胞microRNA194 mRNA水平比較

2.2 兩組荷瘤小鼠肝癌組織microRNA194 mRNA水平比較 結果顯示，microRNA194過表達腫瘤microRNA194 mRNA水平比對照組顯著升高（P＜0.01，圖2），表明我們成功構建了過表達microRNA194的荷瘤小鼠。

圖2 兩組小鼠肝癌組織microRNA194 mRNA水平比較

2.3 兩組小鼠腫瘤體積和質量比較 結果顯示，在接種細胞后第6 d開始，microRNA194過表達組腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05），并隨著時間的延長，差異逐漸變得更顯著（P＜0.01，圖3），兩組小鼠腫瘤質量有類似的變化（資料未列出），表明過表達microRNA194可以抑制肝腫瘤生長。

圖3 兩組小鼠肝癌體積比較

2.4 高表達的microRNA194降低腫瘤組織IGF1R mRNA水平并抑制其蛋白表達 microRNA194過表達組IGF1R mRNA水平顯著低于對照組（P＜0.01，圖4），IGF1R蛋白表達量也顯著降低（圖5），表明高表達的microRNA194可以抑制IGF1R的表達，可能為其抑制肝腫瘤生長的分子機制之一。

圖4 兩組小鼠肝癌組織IGF1R mRNA水平比較

圖5 兩組小鼠肝癌組織IGF1R蛋白表達的比較

3 討論

有人通過對17例不同病因導致的肝癌患者55個臨床樣本進行microRNA高通量分析，發(fā)現(xiàn)一系列microRNA在肝癌的早期階段就發(fā)生了差異性表達，并參與隨后的肝癌進展[1-5]，這些microRNA包括miR-21-5pmiR-375、miR-200a-3p、miR-200b-3pmiR-141-3p、miR-429、miR-16-5p 等[6-9]。

microRNA194也被發(fā)現(xiàn)在肝臟疾病中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，包括肝纖維化、乙型肝炎發(fā)病等[6，20]。研究報道m(xù)icroRNA194和microRNA150水平在肝纖維化大鼠模型的肝臟組織中顯著降低，它們的過表達可以抑制肝細胞增殖、表達平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等細胞外基質，從而在肝臟纖維化過程中發(fā)揮抑制作用[15-20]。但是，目前關于microRNA194在肝癌發(fā)病中的相關報道仍然較少，僅有少數(shù)幾篇報道，如有人發(fā)現(xiàn)，過表達的microRNA194可以降低N-cadherin的表達，從而抑制肝癌細胞的遷移[14]。關于microRNA194抑制肝癌轉移的具體機制，也有人發(fā)現(xiàn)可能與其抑制下游靶基因絲裂原激活蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）的表達有關[6]。盡管如此，microRNA194對肝癌細胞的增殖、凋亡等其他生物學功能仍未闡明，而且具體的信號通路和下游靶基因復雜，仍有待更充分的挖掘。

本文研究了microRNA194過表達對肝癌組織生長的影響，通過細胞轉染的方法構建了過表達microRNA194的肝癌細胞Hep3B，并將其接種于Balb/c裸鼠皮下，采用熒光定量PCR法驗證了荷瘤小鼠肝癌組織中microRNA194 mRNA呈高水平，因此我們成功構建了microRNA194高水平的荷瘤小鼠模型。隨后，我們對腫瘤的體積和質量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)過表達的microRNA194可以顯著抑制肝腫瘤的生長。

為了進一步探討microRNA194的高表達抑制肝癌生長的具體機制，我們對microRNA194下游靶基因的表達情況進行了檢測。在研究microRNA194在骨肉瘤中的作用機制時，有人通過生物信息學方法預測、熒光定量PCR和Western blot等方法檢測發(fā)現(xiàn)，microRNA194可能通過與IGF1R的3’端非編碼區(qū)結合，抑制IGF1R的表達，從而在骨肉瘤的細胞增殖和轉移中發(fā)揮抑制作用[15]。我們在本文中也研究了microRNA194過表達對IGF1R表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)microRNA194過表達組與對照組相比，IGF1R mRNA水平顯著降低，表明高表達的microRNA194可以抑制IGF1R的表達，有可能參與了microRNA194高表達抑制肝腫瘤生長的分子機制。