液相色譜-串聯質譜法快速測定蛇足石杉中的石杉堿甲

李東芹，孫 玲

(華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室，湖北武漢 430070)

蛇足石杉，又名千層塔，為石杉科多年生蕨類植物，民間多用來治療跌打損傷、毒蛇咬傷和燒燙傷等。20世紀80年代，中國醫藥研究工作者從蛇足石杉中分離出強生物活性的石杉堿甲，并引發其藥用價值的研究高潮[1]。石杉堿甲是一種高效乙酰膽堿酯酶抑制劑，具有開發記憶效率的功能。臨床用于治療老年癡呆癥具有確切的療效[2-3]，還有文獻報道可用于重癥肌無力的治療[4-5]。由于人工合成很難得到純化學活性的石杉堿甲，因此從石杉科植物中提取還是其主要來源。目前為止，石杉中石杉堿甲基本都是用高效液相色譜法[6-8]來測定，液質聯用法鮮見報道，有少量血槳中石杉堿甲液質分析的報道[9-10]。液相色譜法耗時長、試劑用量大、靈敏度低、易受其他物質干擾，對前處理工作要求較高，分析誤差大。受前人研究的啟發[11-12]，筆者建立了蛇足石杉中石杉堿甲的液相色譜-串聯質譜方法，樣品經液相色譜分離后進入質譜儀，用石杉堿甲的特征離子對243.2 > 210.1來進行定量測定，為批量定量分析石杉堿甲提供了更好的選擇。

1 材料與方法

1.1儀器API 4000 Qtrap 串聯三重四級桿線性離子阱質譜儀(美國AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；氮吹儀(OA-SYS，N-EVPTM111型)；Milli-pore 超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2試材甲醇(色譜純)；超純水；石杉堿甲(含量≥98%，Mw=242.3)；乙酸(色譜純)；1 mL醫用注射器；0.22 μm微孔濾頭(上海安普)。蛇足石杉采自安徽，為華中農業大學植科院姚明鏡老師提供。

1.3試驗方法

1.3.1樣品制備。精確稱量0.4 g左右的樣品，加氨水潤濕后用適量體積氯仿萃取3～4次，每次約8 h。匯總萃取液，用氮吹儀吹干，用甲醇溶解后定容到25 mL。再用1 mL醫用注射器與0.22 μm過濾頭過濾后移入自動進樣器樣品瓶。

1.3.2標準溶液制備。精密稱取石杉堿甲粉末1.4 mg，甲醇溶解后定容至50 mL，作為標準儲備液。取適量的儲備液，用純甲醇逐步稀釋成濃度為70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 μg/L 系列梯度的標準溶液，依次移入液相色譜自動進樣器樣品瓶。

1.3.3定量檢測條件。

1.3.3.1色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS(150 L×2.0 mm，5 μm)色譜柱，樣品室溫度為室溫；流動相：A為0.1%的乙酸水溶液，B為甲醇；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫條件：A∶B，0 min 為 0∶100(V/V)，10 min為 20∶80(V/V)，10.01 min 為0∶100(V/V)，15 min為0∶100(V/V)，柱溫箱溫度為40 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.3.2質譜條件。采用電噴霧(ESI)離子源，在正離子電離模式下選用多反應離子監測(MRM)掃描模式進行測定。電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

2 結果與分析

2.1質譜解析將濃度為100 μg/L的石杉堿甲標準品通過針泵注射器直接進入質譜分析，先利用Q1全掃描確定石杉堿甲的母離子為243.2(M+1)；再在一定能量下進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到石杉堿甲的碎片離子信息(圖1a)；選擇豐度較大的子離子210.1與母離子243.2組成多反應監測(MRM)離子對進行定量分析。為了確保離子對243.3 >210.1 靈敏度高與信號穩定，分別對解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能量(CE)和碰撞出口電壓(CXP)等質譜參數進行優化，優化后各參數分別為DP為70 V、EP為10 V、CE為40 V、CXP為13 V。

圖1b為石杉堿甲在“1.3.3.2”質譜條件下的選擇離子流圖，其色譜保留時間在1.46 min。

圖1 石杉堿甲的二級質譜圖(a)和總離子流圖(b)Fig.1 Secondary mass spectrum(a)and total ion current map(b)of Huperzine A

2.2標準曲線方程和檢出限將“1.3.2”項配制好的石杉堿甲系列標準溶液按由稀到濃的順序依次放入自動進樣器樣品架，在“1.3.3”項試驗條件下進行聯機分析。以標準溶液濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，得到線性方程為y=11 100x+2 490(r=0.998 9)，表明在濃度為4.375～70.000 μg/L線性良好。

將標準溶液逐步稀釋至11.750、0.875、0.438、0.146 μg/L，在“1.3.3”項試驗條件下逐一分析，最終確定該方法的定量檢出限為0.438 μg/L，信噪比S/N為10。

2.3精密度試驗將精確濃度為17.5 μg/L的標準溶液，重復進樣5次，測定結果分別為18.2、18.1、17.9、17.7、18.4 μg/L。經計算得5次測定結果的變異系數為1.5%，精密度良好。

2.4回收率試驗精確稱量已知石杉堿甲含量的蛇足石杉樣品，分別加入10、30、50 μg/L濃度水平的石杉堿甲標準溶液，按“1.3.2”方法進行樣品制備，每個濃度進行3個樣本分析，與標準曲線同時測定，考察樣品回收率。結果發現(表1)，在這3個濃度下，石杉堿的回收率為96.0%～102.3%，相對標準偏差(RSD)為2.18%。

表1 石杉堿甲的回收率及RSD

2.5方法應用分別稱取蛇足石杉的全株、葉、莖、根，按“1.3.1”項方法進行前處理，在“1.3.3”項試驗條件下測定，通過線性方程分別計算得到其石杉堿甲的含量分別為5.331 4、1.798 2、0.570 3、0.292 0 μg/g。

3 小結與討論

與以往常用的液相色譜檢測方法相比，該研究建立的液相色譜-質譜聯用法具有分析速度快、靈敏高、選擇性好等特點。它將色譜的高分離能力和質譜的高靈敏檢測能力相結合，實現優勢互補，因而大大提高了檢測的靈敏度和選擇性。樣品前處理操作簡單，試劑用量少，既經濟又環保。該方法可為開發和利用蛇足石杉這一藥用植物資源提供有力的技術支持和幫助。