香水蓮花提取物的美白功效研究

孫玉潔， 李春松， 蘆 芳， 吳曉琴， 沈建福*

（1.浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州310058；2.金華市食品藥品檢驗檢測研究院 食品藥品檢驗評審科，浙江 金華 321015；3.浙江蕓麒龍翔生物技術有限公司，浙江 杭州310000）

目前市場有多種皮膚美白劑，如純化學物氫醌，天然植物提取物熊果苷、甘草提取物等。純化學物的美白效果較好，但往往會帶來一些副作用，而天然植物提取物由于安全性高，越來越得到研發者和消費者的青睞。皮膚的美白主要有2種方式，一是抑制黑色素合成酶的活性，如抑制酪氨酸酶，多巴色素互變酶等，以減少黑色素的生成；二是促進黑色素排出，如促進黑色素的吸收代謝等[1]。天然植物提取物的美白作用通常是通過抑制酪氨酸酶活性或阻斷酪氨酸生成黑素的氧化反應，從而減少黑素的合成而達到美白皮膚的效果。

香水蓮花 （Nymphaea hybrid）是睡蓮科睡蓮屬熱帶大型睡蓮，既是一種大型觀賞性花卉，又可安全食用，源于香水蓮花的各種產品也被不斷開發利用。作者通過測定比較提取物對酪氨酸酶活性的影響，篩選獲得效果較好的提取物，再應用B16黑素瘤細胞模型，進一步研究香水蓮花提取物對細胞黑素合成的影響及其對細胞內酪氨酸酶的作用，初步探討其美白作用，以期為純天然美白化妝品的開發提供理論參考。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

黃色、藍色香水蓮花：由浙江一心園農業發展有限公司提供，2014年9月采摘，剝去萼片，從貼近花托基部切除花梗。其中一部分4℃冷藏，另一部分烘干，裝袋備用；香水蓮花子房提取物：由浙江一心園農業發展有限公司提供；酪氨酸酶、L-酪氨酸、熊果苷、二甲基亞砜（DMSO）：上海阿拉丁試劑有限公司；B16小鼠黑素瘤細胞株：上海市中科院細胞庫產品；RPMI 1640培養液：美國Gibco公司產品；HyClone胎牛血清：賽默飛世爾生物化學制品 （北京）有限公司產品；青-鏈霉素溶液、磷酸緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶：杭州科易生物技術有限公司產品；四甲基偶氮唑藍 （MTT）、曲通 （Triton-X100）：北京雷根生物技術有限公司產品；左旋多巴（L-DOPA）：北京索萊寶科技有限公司產品。

1.2 主要儀器

TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產品；CP-ST50A型二氧化碳培養箱：長沙長錦科技有限公司產品；SW-CJ-ZF潔凈工作臺：上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；CKX41倒置顯微鏡：日本奧林巴斯光學工業株式會社產品；MDF-U53V醫用低溫箱：日本松下電器產業株式會社產品；Eon酶標儀：美國伯騰儀器有限公司產品；LDZX-50KBS立式髙壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠產品；25 cm2細胞培養瓶：美國Sigma-Aldrich公司產品；96孔細胞培養板、6孔細胞培養板：美國康寧公司產品。

2 實驗方法

2.1 香水蓮花樣品的制備

分別取曬干后的黃色、藍色香水蓮花整花，去除蟲害、霉變部分后粉碎，過50目篩。按照1 g∶10 mL料液質量體積比，分別用蒸餾水、體積分數20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液（V/V）在 50℃溫度下超聲浸提30 min，所得溶液4 000 r/min離心15 min，取上清液過濾，再經減壓旋蒸除去乙醇，凍干48 h，得到香蓮整花提取物粉末。測定時將其與子房提取物經過超聲重溶配制成所需濃度的溶液待用。

2.2 香水蓮花提取物的活性成分測定

2.2.1 總酚質量分數的測定 沒食子酸標準曲線測定：采用Folin-Ciocalteu法[2]。精密吸取沒食子酸標準溶液 （0.1 mg/mL） 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL具塞試管中，加入1.0 mL Folin-Ciocalteu試劑和2mL15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10mL，充分混勻后于75℃水浴30 min，以試劑空白為參照，在760 nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標（y，A760），沒食子酸質量為橫坐標（x，mg）繪制標準曲線，得到回歸方程y=14.7x-0.000 5（R2=0.999 8）。

香水蓮花提取物總酚質量分數測定：將各提取物配成1.0 mg/mL的待測液，取0.2 mL待測液，按上述步驟測定，根據標準曲線計算提取物干基總酚質量分數。

2.2.2 黃酮質量分數的測定 蘆丁標準曲線測定：參考任紅榮等[3]的方法。精密稱取105℃常壓干燥至恒重的蘆丁標準品0.100 2 g，用體積分數50%乙醇定容至50 mL作為母液。正確吸取蘆丁母液1.5、2.5、4.0、5.0、8.0、10.0 mL 置于 25 mL 容量瓶中，以體積分數50%乙醇定容。吸取2 mL蘆丁標準液，加入2 mL質量分數1%三氯化鋁，振蕩搖勻后室溫放置15 min，以溶劑加質量分數1%三氯化鋁溶液作為空白對照在425 nm處測定吸光值。以吸光值為縱坐標（y，A425nm），蘆丁質量為橫坐標（x，μg）繪制標準曲線，得回歸方程y=0.011 2x+0.009 9（R2=0.999 5）。

將各提取物配成1.0 mg/mL的母液，再將整花提取物母液用體積分數50%乙醇稀釋一倍作為待測液，子房提取物母液作為待測液，按照上述標準曲線方法測定，根據標準曲線計算提取物干基黃酮質量分數。

2.3 香水蓮花提取物的美白功效測定

2.3.1 抑制酪氨酸酶活性測定 采用體外法測定，參考任紅榮等[4]的方法。

總反應體系為5 mL，具體設計見表1。其中，用分光光度計測量吸光值時，受試組、空白組、熊果苷對照組分別以陰性對照組1#、2#和3#管調零。

實驗時，向試管中依次加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度梯度的樣品液和酶液，37℃水浴10 min后加入底物L-酪氨酸，立即計時。反應20 min時測定475 nm波長下的吸光值。測定時以相應的陰性對照為參比，用下列公式計算樣品液和陽性對照對酪氨酸酶的抑制率，依據濃度-酶抑制率曲線計算半抑制濃度（IC50），IC50值低則表明其對酪氨酸酶活性的抑制效果好。

表1 測定酪氨酸酶活性的5 mL試驗體系設計Table 1 Design of the 5 mL test system of tyrosinase activity determination mL

2.3.2 細胞形態觀察 B16小鼠黑素瘤細胞株購于上海市中科院細胞庫。每次實驗取自同一傳代細胞，DMSO質量分數小于0.5%。

參考Chang[5]等的方法，取指數生長期的B16黑色素瘤細胞，經0.25%胰蛋白酶消化分散，調整細胞密度為5×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，再補充RPMI 1640新鮮培養液100 μL，培養12 h待細胞完全貼壁后更換新培養基，每孔加入200 μL不同濃度的受試物溶液，每個濃度設置6個復孔，對照組加入新鮮培養液代替美白劑溶液，每天換液，培養48 h后置于顯微鏡下觀察對照組和實驗組的細胞大小、形態、生長密度、樹突形態以及融合狀態等，并拍照記錄。

2.3.3 MTT比色法檢測細胞增殖率 參考Mei[6]等和陳貞純等[7]的方法。細胞懸浮液前處理同上，細胞接種12 h后用添加受試美白劑的新鮮培養液換液（各設4個劑量組，香水蓮花乙醇體積分數60%提取物和熊果苷的質量濃度梯度為 12.5、25、50、100 μg/mL），每孔加入 200 μL，每個質量濃度設置 6 個復孔，對照組加入新鮮培養液代替美白劑溶液，培養48 h。在測定時間前4 h取出，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，在培養箱中繼續孵育4 h，然后棄去培養基和MTT，向各孔中加入150 μL的DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶，震蕩混勻后用酶標儀測定570 nm下的吸光值。細胞增殖率按以下公式計算：細胞增殖率（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

2.3.4 黑素質量分數測定 選擇對數生長期細胞制成單細胞懸液，以 5×104個/mL接種于6孔培養板，每孔2 mL。貼壁后每孔分別加不同質量濃度含受試美白劑的培養基 （質量濃度梯度為12.5、25、50、100 μg/mL），以不含受試美白劑的空白培養基作為對照。將細胞在37℃、體積分數5%CO2飽和濕度條件下培養48 h，傾去培養液，用PBS緩沖液洗1次，質量分數0.25%胰酶消化，再用PBS緩沖液吹打沉淀細胞，備用。參照Ando等[8]報道的方法測定黑素質量分數。取備用細胞懸液加PBS緩沖液，各吸取1 mL細胞懸液分別置于離心管中，低速離心10 min后棄去上清液，先加入200 μL蒸餾水使細胞重新懸浮，然后加入 1 mLV（乙醇）∶V（乙醚液）=1∶1，在室溫下放置 15 min，3000 r/min 離心 5 min 并棄去上清液，加入1 mL含體積分數10%二甲基亞砜的1 mol/L NaOH溶液，然后置于80℃水浴30 min，最后轉移到96孔板中，用分光光度計在470 nm波長處測定吸光度，單個細胞內相對黑素質量分數=（A實驗組/A對照組）/細胞增殖率 ×100%。

2.3.5 酪氨酸酶活性抑制率測定 參考張春香[9]等和Qiu等[10]的方法。細胞前處理同上，調整細胞數為5×104個/ml，96 孔板每孔加細胞懸液 100 μL， 再補充培養液 100 μL，鋪板 12 h后，棄上清，加入200 μL含不同質量濃度美白劑的培養液（質量濃度梯度為 12.5、25、50、100 μg/mL），在 37 ℃，體積分數5%CO2飽和濕性條件下培養，每一質量濃度設6個復孔，以不添加美白劑培養的細胞作為空白對照，培養48 h，每天換液。

采用多巴氧化法對酪氨酸酶活性進行測定。將孔板中上清液棄去，用PBS緩沖液漂洗后每孔加入1%Triton-X100 40 μL， 迅速放入-80℃冰箱內，30 min后取出于37℃融化，破裂細胞，加入1%LDOPA溶液10 μL/孔，以L-DOPA為本底進行校正，以不加美白劑培養的細胞作為對照，37℃反應30 min，置酶標儀測定450 nm處A450值。

2.4 統計學分析

采用Excel 2013和SPSS 21軟件處理實驗數據，計算結果以均值±標準差（Mean±SD）表示，采用鄧肯多重比較法進行顯著性差異檢驗。

3 實驗結果

3.1 總酚質量分數測定結果

香水蓮花提取物中總酚質量分數如圖1所示，不同體積分數乙醇提取的黃色與藍色整花提取物中，總酚質量分數趨勢一致。且藍色整花醇提物的總酚質量分數普遍高于相同濃度黃色整花醇提物，由圖可知藍色整花體積分數60%醇提物中酚類物質質量分數最高，占提取物干基質量的 （31.62±0.14）%，顯著高于黃色整花的總酚質量分數（30.29±0.19）%（P＜0.01），子房提取物總酚質量分數最低，為（5.19%±0.18）%。

3.2 黃酮質量分數測定結果

如圖2所示，香水蓮花提取物中黃酮質量分數隨提取溶劑乙醇體積分數升高而增加，且黃色整花提取物所含黃酮高于藍色整花，用60%乙醇提取時，這兩種整花提取物所含黃酮分別占干基質量的（5.37±0.05）%和（3.72±0.06）%，而在 100%乙醇提取時分別上升至 （10.42±0.05）%、（6.35%±0.03）%，增加了將近一倍。子房提取物的黃酮質量分數最低，為（1.90±0.04）%。由此可見，香水蓮花中低極性的黃酮質量分數比高極性的多。

圖1 香水蓮花提取物總酚質量分數Fig.1 Polyphenols content of Nymphaea odorata Aiton extracts

圖2 香水蓮花提取物黃酮質量分數Fig.2 Flavones content of Nymphaea odorata Aiton extracts

3.3 抑制酪氨酸酶活性測定結果

酪氨酸酶是酪氨酸轉變為黑色素的主要限制酶，可催化含酚基化合物（如酪氨酸、酚類化合物等）氧化成多巴醌，經一系列中間反應后形成黑色素[11]，反應過強可引起黑素過多癥，如雀斑、黃褐斑等[12]。如圖3所示，不同體積分數乙醇溶劑提取的黃色整花提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果與藍色整花提取物一致，子房提取物較低，熊果苷較高。該結果與提取物中總酚質量分數趨勢一致，推測提取物中含有能抑制酪氨酸酶活性的酚類物質。

由表2可知，相同質量濃度下，藍色整花提取物對酪氨酸酶活性抑制率的IC50值普遍低于黃色整花提取物，因此藍色整花提取物的抑制酪氨酸酶活性效果好。用體積分數60%乙醇提取的黃色、藍色整花提取物均具有良好的抑制酶活性效果，其中體積分數60%藍色整花醇提物在所有香水蓮花樣品中抑制酪氨酸酶活性效果最好，IC50值僅為（0.59±0.01）mg/mL，抑制效果與熊果苷無顯著差異。

圖3 香水蓮花提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition oftyrosinaseactivity by Nymphaea odorata Aiton extracts

表2 香水蓮花提取物對酪氨酸酶活性抑制率IC50值Table 2 Inhibition rate of IC50values （mg/mL） on tyrosinase activity by Nymphaea odorata Aiton extracts mg/mL

3.4 細胞形態觀察結果

傳代的B16小鼠黑素瘤細胞主要為兩極貼壁生長的上皮型細胞，偶見三極生長。添加香水蓮花提取物后進行細胞培養，結果顯示：整花體積分數60%醇提物可干擾細胞增殖，使細胞生長受到抑制，而熊果苷和子房提取物對細胞生長無明顯影響。

從圖4可見，對照組細胞生長良好，形態正常，添加100 μg/mL質量濃度的熊果苷和子房提取物的細胞生長狀況與對照組相近，而在香水蓮花提取物作用下，細胞分布稀疏，尤其是添加了藍色整花體積分數60%醇提物培養的細胞，細胞樹狀突起減少、縮短，許多細胞呈圓形或不規形狀孤立存在，細胞之間很難相互融合形成網狀互聯結構，導致細胞旁分泌和細胞間隙通訊減弱，難以實現細胞正常生理功能。

圖4 100 μg/mL香水蓮花提取物對細胞生長的影響Fig.4 Effect of Nymphaea odorata Aiton extracts（100 μg/mL）on cell growth

3.5 細胞增殖率測定結果

由圖5所示，香水蓮花60%醇提物在低質量濃度時，對細胞生長無明顯影響；當質量濃度達到50 μg/mL時，黃色和藍色整花體積分數60%醇提物對B16小鼠黑素瘤細胞增殖開始有顯著抑制作用，增殖率分別為（90.17±3.23）%和（83.59±2.04）%；在100 μg/mL濃度下，添加黃色、藍色整花60%醇提物的細胞增殖率分別下降到 （84.44±1.77）%、（48.24±3.14）%，顯著低于熊果苷，可見醇提物中活性成分能夠減緩瘤細胞增殖。許多文獻報道，天然植物提取物如蘆薈苦素[13]和甘草提取物[14]能夠有效抑制黑素瘤細胞增殖，起到美白作用。添加了熊果苷培養的細胞增殖率為（98.89%±2.55）%，說明熊果苷對細胞增殖無顯著影響。子房提取物具有少許促進細胞生長的作用，可能是因為子房提取物中含有糖類等營養成分，被細胞吸收利用從而促進增殖。

圖5 香水蓮花提取物對細胞增殖率的影響Fig.5 Effect on cell proliferation rate by Nymphaea odorata Aiton extracts

3.6 黑素質量分數測定結果

黑素存在于表皮的基底層，它是決定皮膚顏色的主要因素。皮膚中黑色素質量分數越少，則膚色越淺。由圖6可知，香水蓮花提取物均有抑制細胞合成黑色素的作用，以空白對照的單個細胞內黑素質量分數為100%，則添加提取物后黑素質量分數明顯降低，并呈現劑量-效應關系。在100 μg/mL時，添加黃色整花體積分數60%醇提物培養的細胞中黑素相對質量分數減少了30.31%，藍色整花體積分數60%醇提物減少33.02%，抑制黑素合成效果均良好，但由于其為混合初提物，而熊果苷為純物質，其抑制效果沒有熊果苷好。子房提取物對黑素生成的抑制也有一定效果，100 μg/mL質量濃度時使單個細胞內相對黑素質量分數減少20.90%，但不如整花提取物。

圖6 香水蓮花提取物對相對黑素質量分數的影響Fig.6 Effect on relative content of melanin by Nymphaea odorata Aiton extracts

3.7 酪氨酸酶活性抑制率測定結果

黑色素合成過程中的關鍵酶主要有3種：酪氨酸酶、多巴色素互變酶和5，6-二羥吲哚-2-羧酸氧化酶，一般可通過抑制酪氨酸酶的活性從而減少黑色素的合成量。如圖7所示，隨著濃度升高，提取物和陽性對照熊果苷對酪氨酸酶活抑制率均逐步上升，在100 μg/mL質量濃度時，藍色整花體積分數60%醇提物與熊果苷對酪氨酸酶活性的相對抑制率相當，達到（59.47±3.40）%，顯著高于黃色整花 60%醇提物，子房提取物對酶活的抑制效果并不明顯。該結果與B16小鼠黑素瘤細胞內黑素相對含量的結果相一致，也與體外酪氨酸酶活性抑制率具有一致性，因此，實驗表明香水蓮花提取物有較好的降低細胞內酪氨酸酶活性的作用，從而有效減少細胞內黑色素的合成量。

圖7 香水蓮花提取物對酪氨酸酶活性相對抑制率的影響Fig.7 Effect on relative inhibition rate of tyrosinase activity by Nymphaea odorata Aiton extracts

4 結 語

豐富多彩的物種資源為美白研究提供了大量的試驗材料，從天然產物中提取活性成分成為篩選研究的熱點[15]。作者通過體外法測定酪氨酸酶活性和細胞模型法測定黑素含量等指標研究了香水蓮花提取物的美白效果。

酪氨酸酶是一種含銅的金屬氧化還原酶，廣泛分布于動植物、微生物及人體中，具有單酚酶和二酚酶活性[16]，酪氨酸酶位于黑色素體膜上，其活性中心的雙核銅離子在酶催化中起重要作用，是黑色素生成的關鍵酶[17]，其活性越強，則黑色素合成數量越多，膚色越深。

體外以酪氨酸為底物測定酪氨酸單酚酶活性的結果表明，不同體積分數乙醇提取的黃色和藍色整花提取物對酪氨酸酶活性的抑制效果強弱具有一致性，均為體積分數60%醇提物效果最好，表明整花提取物具有較好的抑制酪氨酸酶單酚酶活性的作用。同濃度時藍色整花提取物抑制效果較黃色整花提取物和子房提取物好，可能是由于藍色整花提取物中酚類含量較高。藍色整花體積分數60%醇提物對酪氨酸酶活性的抑制率與熊果苷相當，表明其具有很好的美白功效。有許多研究表明，多種花類提取物均具有很好的酪氨酸酶活性作用，如蘭花提取物[18]、薰衣草精油[19]、檳榔花沸水提取物[20]、仙蜜果花醇提物[21]等，可作為有效的酪氨酸酶抑制劑。

利用離體細胞培養來篩選美白劑的細胞生物學方法，較人體實驗更快速、簡便，已成為美白功效評價的重要手段。天然植物成分往往具有抗氧化能力，能把黑素合成的中間體還原為無色的多巴色素，淡化皮膚顏色；有些還能使黑素細胞增殖減緩，從而抑制黑色素的產生[22]；有機酸類物質能加快基底層細胞分裂，逐漸向上推移到表皮層，最后角化脫落[23]，從而促使黑色素排出。B16細胞模型實驗結果顯示，體積分數60%醇提物具有抑制細胞增殖的作用，且在100 μg/mL濃度時抑制效果顯著，細胞數目明顯減少，形態改變，子房提取物和熊果苷對細胞形態無影響。有文獻報道，以多巴為底物，熊果苷對酪氨酸酶有競爭性抑制作用[24]。實驗結果表明，以L-多巴為底物測定細胞內酪氨酸二酚酶活性，藍色整花體積分數60%醇提物的抑制效果與熊果苷相當，且其細胞增殖率較熊果苷低，細胞中黑素相對質量分數也為藍色整花體積分數60%醇提物低于黃色，均比子房提取物效果好，添加熊果苷的黑素質量分數最低，可知香水蓮花提取物能通過抑制酪氨酸酶活性及減少細胞增殖從而降低黑素生成量，表明香水蓮花提取物在美白方面具有較好的應用前景。