牡丹籽油及植物提取物的降血糖降血脂活性

蘇建輝 ， 張 玉 ， 劉成祥 ， 馬朝陽 ， 聶榮京 ， 高傳忠 ， 王洪新 *

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051；3.國家功能食品工程技術研究中心，江南大學，江蘇 無錫214122；4.銅陵瑞璞牡丹產業發展有限公司，安徽 銅陵244000）

糖尿病是一種普遍的代謝紊亂癥，由胰島素分泌缺陷或胰島素敏感性降低引起，導致碳水化合物、脂類和蛋白質代謝障礙[1]。心腦血管疾病在世界范圍內逐年增長，降低膽固醇水平可以減少這種疾病的發病率[2]。藥用植物在一些國家已經控制了糖尿病和高血脂[3-5]，成為安全有效降糖和降血脂藥物的主要來源。此外已經從這些藥用植物中取得降血糖降血脂的功能性成分，例如，黃酮、皂甙、生物堿、多糖和不飽和脂肪酸等[6]。植物源的天然產物相比于合成產物，被認為是毒性更小或者沒有副作用。多年來，這些植物已經被用于治療醫學上的各種疾病。雖然一些傳統中藥或者提取物的降糖效果已經被報道，但是復方降血糖效果很少被研究。正交t值法目前已被用于中藥主要成分研究[7-12]。目前已有很多天然產物被報道了對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、膽固醇酯酶和胰脂肪酶4種酶及膽固醇膠束溶解度的抑制效果。作者以5個指標的抑制率為評價指標，用正交t值法研究各功能因子的主要成分，加權綜合的方法分析協同效應，D值優化法確定復方配比。從天然產物中尋找對消化酶具有抑制活性的功能因子，為輔助治療高血糖、高血脂保健食品的配方研發提供現代科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物提取物 銀杏黃酮（95%）、EGCG、槲皮素、絞股藍皂甙、丹皮酚、魔芋多糖、葛根素純度為98%；枸杞多糖、玉竹多糖和苦瓜提取物 （苦瓜素）純度為80%以上，均購于南京景竹生物科技公司。牡丹籽油：銅陵瑞璞牡丹產業發展有限公司產品。1.1.2 實驗試劑 可溶性淀粉、3，5-二硝基水楊酸、酚酞、橄欖油、麥芽糖、對硝基苯-β-D半乳糖吡喃 糖 苷 （p-Nitrophenyl α -D-glucopyranoside，PNPG）、95%乙醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、丙三醇均為國藥集團分析純；α-葡萄糖苷酶、豬胰脂肪酶、α-淀粉酶、膽固醇脂肪酶購于西格瑪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-淀粉酶活性抑制體系 取 50 μL α-淀粉酶（2 U/mL）和一定濃度抑制劑溶液，在37℃孵化10 min，加入質量分數0.75%可溶性淀粉1 mL，37℃反應5 min后加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻后，稀釋至適當倍數在520 nm波長測定吸光度（拜糖平為陽性對照）[3]。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系 取PNPG 100 uL（10 mmol/L）加入 850 uL 磷酸緩沖液（PH 6.8）。再加入樣品溶液，空白對照（不加酶的反應體系）以消除PNPG本身氧化產生對硝基苯酚（PNP）而影響測定結果。37℃孵化10 min，加入酶50 uL（2 U/mL），再孵化 50 min，加入 1 mL Na2CO3終止反應。405 nm測吸光度（拜糖平為陽性對照）。

1.2.3 胰脂肪酶活性抑制體系 取50 mL三角瓶數個，每瓶加入5 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液和 1 mL橄欖油作為底物，置于40℃水浴保溫5 min，然后在瓶中（除空白外）各加入 50 μL酶液（5×100-400 U/mL），從加入脂肪酶開始精確計算時間，反應5 min后，立即加入體積分數95%乙醇15 mL，終止酶反應，再加1%酚酞2～3滴，用0.025 mol/L氫氧化鈉滴定至淡紅色（胰脂肪酶為陽性對照）[14]。

1.2.4 膽固醇酯酶反應體系 對膽固醇酯酶的抑制活性測試，測試溫度保持在（25.0±0.2）℃。所有的反應在含有NaCl（0.1 mol/L）、對硝基苯基丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，PNPB 0.2 mmol/L）、牛磺膽酸鈉 （5.16 mmol/L）的磷酸鈉緩沖液 （0.1 mol/L，pH 7.0）中進行。膽固醇酯酶預先溶解在高純水中20 ug/mL；底物PNPB和抑制劑預先溶解在乙腈中，在-20℃保存。加入豬胰腺膽固醇酯酶（0.72 U/mL）啟動反應，25.0℃反應5 min，在405 nm紫外可見分光光度計檢測[15]。

1.2.5 膽固醇膠束溶解度反應體系 1 mL膠束溶液中含有 10 mmol/L牛磺膽酸鈉，2 mmol/L膽固醇，5 mmol/L 油酸，132 mmol/L 氯化鈉，15 mmol/L磷酸緩沖液 （pH 7.4）。超聲波均質進行制備。37℃隔夜靜置。將空白對照，一定量的功能因子分別加入到膠束溶液中，然后將混合溶液在37℃振蕩培養 2 h，并在 16 000 r/min離心 20 min，收集上清液用試劑盒測定膠束中膽固醇含量[16]。

1.2.6 正交t值法-主藥分析 將篩選出來的功能因子每種為一個因素，隨機命名為A、B、C、D、E等。分別是茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、絞股藍皂甙和苦瓜提取物。每個因素設2水平，水平1為添加，水平2為不添加。根據功能因子對應α-淀粉酶和膽固醇酯酶IC50確定其在每組方中的比例用量。實驗選用L12（211）正交t值表進行；各組通過對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性的抑制效果（0.5 mg/mL），加權綜合確定主成分（1∶1），數據越大，作用越強。通過數據分析找出主藥和輔藥。

1.2.7 輔藥交互作用 用正交t值和加權綜合分析方法（1∶1）分析輔藥和主藥及輔藥之間的相互作用，以功能因子對α-淀粉酶和膽固醇酯酶的活性抑制效果為檢測指標。

1.2.8D值優化法劑量配比 以各功能因子對α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50為劑量選擇依據，適當增減。計算質量濃度為0.5 mg/mL時功能因子不同劑量配比對α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的抑制率。值越大，配比效果越好，選出最優配比[17]。

2 結果與分析

2.1 功能因子對消化酶和膽固醇膠束溶解度抑制率體外研究

以0.5 mg/mL抑制劑對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果為評價標準。由圖1可以看出EGCG對α-淀粉酶、胰脂肪酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果最好，達到95%、93%和100%。苦瓜提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好為87%。槲皮素對膽固醇酯酶的抑制效果最好，為92%。丹皮酚和枸杞多糖雖然對α-葡萄糖苷酶抑制效果較好，但是與前幾種功能因子相比，其對膽固醇膠束溶解度、α-淀粉酶、胰脂肪酶酶，膽固醇酯酶的效果比較弱。所以根據以上研究結果，EGCG、絞股藍皂甙、槲皮素、牡丹籽油和苦瓜提取物對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果較好。因為茶多酚和銀杏黃酮分別含EGCG和槲皮素比較多，所以最后確定茶多酚、銀杏黃酮、絞股藍皂甙、牡丹籽油和苦瓜提取物作為復方的功能性成分。

2.2 功能因子對消化酶和膽固醇膠束溶解度的抑制率

圖2比較了5種功能因子對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的IC50值。由圖2可以看出，與其他4種成分相比，茶多酚對胰脂肪酶，α-淀粉酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果明顯強于其他4種成分，其IC50值分別是0.45、0.42和0.15 mg/mL低于其他4種成分，且茶多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果強于荷葉黃酮 （2.20 mg/mL，1.86 mg/mL）[18]；茶多酚對胰脂肪酶活性的抑制效果優于刺五加皂甙（0.75 mg/mL）[19]。但是茶多酚對膽固醇酯酶的抑制效果最弱。苦瓜提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好，其IC50值為0.41 mg/ml，圓葉葡萄甲醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制IC50值為1.50 mg/mL[20]。銀杏黃酮對膽固醇酯酶的抑制效果最好，其IC50值為0.26 mg/mL低于已報道的苦瓜水提物對膽固醇酯酶的抑制效果[21]。

圖 2 5種功能因子對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和膽固醇膠束溶解度的IC50Fig.2 IC50value of pancreatic lipase，α -amylase，α -glucosidase，cholesterol eaterase and cholesterol micelle solubility by 5 functional factors

2.3 正交t值法-主藥分析

結果顯示，茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性加權綜合抑制效果作用顯著，因此茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮是復方主藥成分。絞股藍皂甙和苦瓜提取物可能為輔藥。

2.4 正交t值輔藥交互作用分析

用正交表著重分析輔藥彼此間的交互作用，A（茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮）、B（絞股藍皂甙）、C（苦瓜提取物）質量濃度為0.5 mg/mL，按照圖2 IC50的比例設置濃度配比。

由表8可以看出，絞股藍皂甙和苦瓜提取物與復方主要成分可以協同性抑制膽固醇酯酶和α-淀粉酶活性。

2.5 D值優化法復方功能性成分配比

各因素確定后，篩選出來的功能因子每種為一個因素，隨機選定為A、B、C、D、E等。每個因素設3個水平，從胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度5個評價指標中任意選取3個。以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50值為水平劑量依據，在此基礎上適當增減（如表5）。總質量濃度是0.5 mg/mL，根據α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶活性抑制率，用D值優化法進行劑量優化分析。

表2 主藥分析的實驗結果Table 2 Result of primary medicine analysis

表3 因素及水平Table 3 Factors and level

表4 正交t值法分析輔藥交互作用（n=3）Table 4 Analysis of adjuvant interaction by orthogonal t value design

表5 因素及水平Table 5 Factors and level

圖3 D值法優化實驗數據處理結果Fig.3 Analysis table of dose optimization by D value optimization

由復方對3種酶的抑制效果可以看出，A3質量濃度（苦瓜提取物）時，復方對膽固醇酯酶，α-葡萄糖苷酶的抑制效果優于A1和A2質量濃度；B1、B2和B3（銀杏黃酮）3種質量濃度的比較可以看出，B3濃度時，復方對α-淀粉酶和膽固醇酯酶的抑制效果優于B1和B2；C2（茶多酚）時，復方對膽固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果優于C1和C3；D1（絞股藍皂甙）時，復方對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶的抑制效果優于D2和D3，E2（牡丹籽油）時，復方對膽固醇酯酶和α-淀粉酶的抑制效果優于E1和E1。因此，根據復方5種功能因子3個水平對3種消化酶活性的抑制效果可以看出A3、B3、C2、D1和E2是復方的最佳質量濃度， 最佳劑量配比為A3∶B3∶C2∶D1∶E2=m（苦瓜提取物）∶m（銀杏黃酮）∶m（茶多酚）∶m（絞股藍皂甙）∶m（牡丹籽油）=8∶8∶6∶5∶8。 復方對 α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50值分別為0.40、0.38 和 0.32 mg/mL。

3 結 語

首先比較了9種功能因子對膽固醇酯酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果，最后確定茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及絞股藍皂甙作為復方的功能成分，并且計算出IC50值。以功能因子對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性抑制效果IC50為依據，對茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及絞股藍皂甙5種成分進行主藥分析及輔藥交互作用分析。正交t值法源于正交設計，適合多味藥的復方研究，可以用較少的試驗次數分析較多的因素，找出各因素的主次地位及交互作用。D-優化實驗設計在總量不變的基礎上用較少的實驗設計實現多目標同步優化。作者結合了正交t值和D-優化實驗的優點，正交t值法進行了主藥分析和輔藥交互作用分析，用D-優化實驗實現α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶多目標同步優化，確定了最優劑量配比（IC50值分別是 0.40、0.38、0.32 mg/mL），其對消化酶活性的抑制效果強于已報到的植物提取物荷葉黃酮、刺五加皂甙、圓葉葡萄甲醇提取物及苦瓜水提物[18-20]。

目前已有大量文獻報道了功能因子對胰脂肪酶、α-淀粉酶[22]、α-葡萄糖苷酶[23]、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果[24]。茶多酚對膽固醇膠束溶解度、胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶抑制效果的研究已有報道[25]。目前還沒有研究發現銀杏黃酮對胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的作用效果，但是Liu研究了荷葉黃酮對胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果[18]，其IC50值分別是0.38、2.20和1.38 mg/mL，本研究中銀杏黃酮對其的IC50值分別是1.21、0.76和0.51 mg/mL。雖然荷葉黃酮對胰脂肪酶的抑制效果優于銀杏黃酮，但是銀杏黃酮對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果優于荷葉黃酮。Hassan和Cheng研究了銀杏提取物（銀杏黃酮24%）體內降血糖效果，與未經處理的糖尿病小鼠相比，銀杏提取物顯著性降低了糖尿病小鼠的血糖水平 （p＜0.05）。磷酸化黃酮對膽固醇酯酶的抑制效果已被研究，其IC50值從納摩爾級到微摩爾級，但是也有一些沒有表現出抑制效果[26]。這些合成的抑制子不同的抑制活性歸因于構效關系。然而實驗中銀杏黃酮或者配方對膽固醇酯酶活性抑制的IC50值分別是 0.26和 0.32 mg/mL（圖 2），雖然合成的納摩爾級的抑制子有更好的抑制效果，但是在食品工業中使用天然產物代替合成抑制子是一種發展趨勢。Liu研究了人參皂甙[27]對胰脂肪酶的抑制效果，人參皂甙0.5 mg/mL對胰脂肪酶的抑制率為10.1%，且動物實驗也表明了體外酶抑制實驗和體內動物降血脂實驗的相關性，配方中的茶多酚對胰脂肪酶抑制率IC50值為0.45 mg/mL，絞股藍皂甙對胰脂肪酶抑制率IC50值為0.58 mg/mL，茶多酚和絞股藍皂甙對胰脂肪酶的抑制效果優于人參皂甙。Lee研究了桔梗皂甙對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，桔梗皂甙1 mg/mL對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為35%，本研究的配方對α-葡萄糖苷酶的IC50值為0.38 mg/mL，配方的抑制效果優于桔梗皂甙[28]。Santoscoy研究了黑豆皂甙和黃酮對膽固醇膠束溶解度的抑制效果，黑豆皂甙5 mg/mL時對膽固醇膠束抑制率為55.4%[29]，本研究配方的5種成分對膽固醇膠束溶解度抑制率IC50＜3.0 mg/mL。Su研究報道了油酸、亞油酸和α-亞麻酸對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，研究發現油酸、亞油酸和α-亞麻酸對α-葡萄糖苷酶活性抑制率IC50值分別是0.022、0.033 和 0.044 mg/mL[30]，對 α-淀粉酶活性抑制率均大于1 mg/mL，在本實驗中牡丹籽油對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率分別是1.21和0.61 mg/mL，配方對其的抑制率分別是0.40和0.38 mg/mL，由此可見配方中的牡丹籽油可以和其他四種成分協同性抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。從以上報道可以看出，配方5種成分可以有效地降低胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶活性和膽固醇膠束溶解度，并且目前沒有研究這5種成分的協同效應的報道，作者通過正交t值或D優化法優化組合了5種功能因子的劑量，結果表明功能因子復方體外有效地降低小腸消化酶及膽固醇膠束溶解度，且抑制效果優于單一成分。