小金海棠多酚對肝纖維化的改善及機制研究

韋月平， 王 鵬

（遼東學院 農學院，遼寧 丹東 118003）

肝臟是機體生物轉化和物質代謝最重要的器官，肝臟損傷是由體內外各種刺激因子侵襲所誘發的炎癥反應導致的[1]。各種慢性肝損傷都會引發肝細胞壞死、炎癥并繼發纖維化的病理特征，從而導致肝纖維化[2]。研究表明，氧化應激是引起肝損傷發生的主要機制之一，在氧化應激狀態下，抗氧化系統失衡，自由基過量生成，炎癥過度積累，最終造成肝臟損傷[3]。

小金海棠（Malus xiaojinensis）是中國自主篩選出的第一個抗缺鐵黃葉病蘋果基因型，已在國內廣泛種植開發[4]，其果實內含有豐富的營養成分，特別是多酚類物質質量分數可達0.9%，主要包括蘆丁、根皮苷、綠原酸、槲皮素、表兒茶素、兒茶素、原兒茶酸、金絲桃苷以及少量對香豆酸和阿魏酸等[5]。研究顯示植物多酚類物質具有超強的抗氧化活性和降血糖、降血脂、保護心腦血管、抗癌、抗菌等多種活性作用[6-7]。但是對于小金海棠多酚（MXP）的活性研究較少。作者擬采用皮下注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型，探討小金海棠多酚對CCl4誘導小鼠肝纖維化的改善作用及機制，以期為小金海棠功能食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物：SPF級 6～8周齡雄性昆明小鼠（KM）：購于遼寧長生生物技術有限公司（SCXK 2015-0001）。

實驗材料：小金海棠多酚 （Malus xiaojinensisPolyphenols，MXP），作者自提取于新鮮小金海棠果，純度＞90%。

實驗試劑：CCl4（分析純，純度＞99.5%）：購于鼎國生物技術有限公司；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所；蘇木素伊紅染色試劑盒（HE試劑盒）：購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Infinite F200/M200型酶標儀：TECAN公司產品；5430R型臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品；ND-2000超微量核酸蛋白測定儀：賽默飛世爾科技公司產品；ABI 7500定量PCR儀：美國應用生物系統公司產品；組織切片機：德國Leica公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理 小鼠經1周適應飼養后，隨機分成實驗組與對照組。實驗組用體積分數20%的CCl4橄欖油皮下注射，同時實驗組分為3組每天進行相應的灌胃處理，即模型組（生理鹽水）、低劑量組（10 mg/kg）和高劑量組（20 mg/kg）。 每周稱量小鼠體質量，觀察其活動及精神狀態，處理6周后，眼球采血，處死后摘取肝臟。

1.3.2 血清ALT和AST活性測定 眼球取出的血液4℃靜置1 h后以3 500 r/min于4℃離心10 min，取上清即為血清。按照試劑盒操作方法測定血清ALT和AST活性。

1.3.3 肝臟指數的測定 取肝組織1 g，加入9 mL的生理鹽水，制成勻漿并測定其濃度。按照試劑盒操作方法測定ALT、AST及SOD、GSH-PX活性。

1.3.4 HE染色 取小鼠肝臟用體積分數4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規脫水、透明、封片。用顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 肝組織炎癥細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α測定 每實驗組取3只小鼠的肝組織各20 mg，提取總RNA。RT-PCT檢測炎性細胞因子轉錄水平。炎性細胞因子引物設計如下：腫瘤壞死因子（TNF-α），上游 5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′，下游 5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′；白細胞介素 （IL）-1， 上游 5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAA CT-3′， 下游 5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′；IL-6，上游 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′，下游 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′。 β-actin作為內參。

1.3.6 數據統計處理 結果采用平均值±標準差格式。不同組間結果比較用單因素方差分析，統計結果p＜0.05認為差異顯著，所有結果統計用SPSS軟件。

2 結果與分析

2.1 小金海棠多酚（MXP）抵御小鼠肝纖維化過程中體質量的變化

肝纖維化會導致體內代謝障礙，通常會出現體質量的減輕的癥狀 。如圖1所示，2周過后CCl4建模小鼠體質量明顯低于正常組。小金海棠多酚（MXP）對小鼠肝纖維化伴隨的體質量降低有著明顯的抵抗作用，20 mg/kg MXP組在第5周與第6周的效果非常顯著（P＜0.01、P＜0.001）。

圖1 小金海棠多酚對小鼠肝纖維化過程中體質量變化的影響Fig.1 Effect of MXP on the body weight of mice in Hepatic Fibrosis

2.2 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝指數的影響

如圖2所示，纖維化小鼠的肝指數也顯著低于正常組（p＜0.05）。MXP對肝指數的降低有一定的抵抗效果，而且隨著其劑量的增加，效果會愈加明顯，其中20 mg/kg組的肝指數為0.041，已經非常接近正常組的0.043。其結果顯示，MXP對于肝損傷導致的肝萎縮有一定的緩解作用。

圖2 小金海棠多酚對肝纖維化小鼠肝指數的影響Fig.2 Effect of MXP on the liver index of mice in Hepatic Fibrosis

2.3 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠血清中ALT與AST活性的影響

谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）升高是肝臟發生損傷的重要生化指標[8-9]。如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT與AST活性均顯著升高（p＜0.001）。與模型組相比，灌胃MXP可顯著抑制血清中ALT與AST活性升高 （p＜0.001），且20 mg/kg劑量組的效果優于10 mg/kg劑量組。

圖3 小金海棠多酚對肝纖維化小鼠血清中ALT與AST活性的影響Fig.3 Effect of MXP on serum lipid （ALT，AST）of mice in Hepatic Fibrosis

2.4 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中ALT與AST水平的影響

MXP對肝臟中ALT與AST的活性的影響和血清中的情況相似，如圖4所示，正常組的ALT、AST明顯小于模型組（P＜0.005），分別達到 111.4 U/g和215.0 U/g。MXP可以顯著降低二者的活性 （P＜0.001），并且20 mg/kg的效果更加明顯，其中ALT降至 51.3 U/g，AST 降至 130.9 U/g。

圖4 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中ALT與AST水平的影響Fig.4 Effect of MXP on ALT andAST in liver of mice in Hepatic Fibrosis

2.5 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活性的影響

抗氧化酶（包括SOD與GSH-PX）作為生物體重要的一類蛋白因子，抗氧化活性降低會引起許多慢性疾病及衰老的發生，其中就包括肝損傷[10]。如圖5所示，肝纖維化小鼠肝臟中的抗氧化酶活性明顯小于正常小鼠，特別是GSH-PX（P＜0.001）。而MXP能顯著抑制這種狀況，而且隨著劑量的升高效果愈加顯著，20 mg/kg時 SOD的顯著性為 0.05，GSHPX的顯著性為0.001。

圖5 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活性的影響Fig.5 Effect of MXP on SOD and GSH-PX in liver of mice in Hepatic Fibrosis

2.6 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟病理形態的影響

正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，顯微鏡觀察到肝細胞排列規則，胞質豐富，核大而圓，核仁清晰。肝纖維化模型的肝臟發生明顯病理改變，其表面無光澤，光鏡下觀察到其細胞出現嚴重的炎癥反應，肝細胞出現中至重度病變，胞漿疏松、細胞核多皺縮。MXP能夠緩解肝損傷，特別是20 mg/kg組，其結構完整，肝索呈放射狀排列，部分肝細胞僅見輕度的病理改變。

2.7 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中炎癥因子表達的影響

肝纖維化的發生是多因素過程，與多個相關細胞因子有關。IL-1、IL-6及TNFα是機體內常見的炎性細胞因子。如圖7所示，肝纖維化小鼠體內的炎性細胞因子水平明顯高于正常小鼠，轉錄水平IL-1為 6.29、IL-6 為 8.10、TNF-α 為 2.00，其中 IL-6和 TNFα 最為顯著（P＜0.01），而 MXP能顯著降低炎癥的發生，20 mg/kg組的效果比較顯著，3類炎癥因子轉錄水平可降低至1.83、4.07、0.85。實驗結果顯示，MXP可能通過抑制炎癥的發生對對肝纖維化進行抵御。

圖6 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟病理形態的影響Fig.6 Effect of MXP on Morphologic of Pathology inliver of mice in Hepatic Fibrosis

圖7 小金海棠多酚（MXP）對肝纖維化小鼠肝臟中相關炎癥因子表達的影響Fig.7 Effect of MXP on the expression of inflammatory cytokines in liver of mice

3 結 語

實驗結果表明，小金海棠多酚能顯著抵御皮下注射CCl4引發的肝纖維化，這種效果可能與其強抗氧化性有關[11]，并且它還能抑制炎癥的發生包括IL-1、IL-6 及 TNF-α。

肝臟是機體的主要代謝器官，容易被中間活性物質氧化損傷。肝損傷主要是由于生物膜功能受到損害，體內酶的活性失衡，在細胞因子（如IL-1，IL-6，TNF-α）的共同作用下引起的[12]。SOD 與 GSH-PX作為機體內重要的抗氧化酶可以保護肝臟免受中間活性物質引起的氧化損傷[13]。作者選取這2個關鍵抗氧化酶作為檢測目標，發現小鼠在CCl4注射6周后，兩者活性明顯下降，而小金海棠多酚組的活性顯著高于CCl4模型組，這說明小金海棠多酚能改善氧應激引起的氧化系統的失衡，對肝纖維化形成過程中的過氧化有一定的抑制作用，從而起到保肝護肝的作用。

肝損傷，特別是肝纖維化的形成是多種致病因子引起的肝臟炎癥或損傷后組織修復過程中的代償反應，所以控制細胞炎癥的發生是預防治療肝纖維化的重要手段。研究結果顯示，CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝細胞內的炎癥水平 （IL-1，IL-6及TNF-α）明顯高于正常小鼠，同時小金海棠多酚處理之后的小鼠肝內的炎癥也明顯受到了抑制，特別是IL-6和TNF-α，這說明小金海棠多酚可能是通過抑制肝內炎癥的發生來抵御肝損傷。

小金海棠多酚可能對肝纖維化有一定的抵御作用，其作用機制可能是通過抗氧化作用和降低機體炎癥的發生而對肝纖維化進行抑制。