可得然膠生產(chǎn)菌種的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

王蕭玉竹 ， 董晉軍 ， 許國超 ， 韓瑞枝 ， 倪 曄 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

可得然膠是一種由D-葡萄糖以β-1，3糖苷鍵連接組成的無支鏈的胞外多聚糖[1]。產(chǎn)可得然膠的菌株主要是糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis），也有少量三葉草根瘤菌屬（Rhizobium trifolii）[2]、放射土壤桿菌（Agrobacterium radiobacter）[3]等其他菌種生產(chǎn)可得然膠的報(bào)道。可得然膠不溶于水、乙醇，易溶于堿液，二甲基亞砜，具有獨(dú)特的熱凝性質(zhì)，當(dāng)被加熱至55℃時(shí)，可形成低固型凝膠，繼續(xù)加熱至80℃以上，可以形成有較高強(qiáng)度和彈性的高固型凝膠[4-5]。由于這一特殊性質(zhì)，使得可得然膠在食品方面有著極其廣泛的應(yīng)用，可以作為食品增稠劑、結(jié)構(gòu)改良劑應(yīng)用于果凍、面條、可食用纖維以及新型減肥保健食品[6]。近年來，隨著對可得然膠性質(zhì)的深入挖掘，可得然膠在醫(yī)藥方面的作用也日益凸顯。研究發(fā)現(xiàn)，可得然膠可以作為藥物傳遞的載體，其硫化、胺化衍生物具有免疫學(xué)功效，可用于腫瘤治療等[7-8]。可得然膠是繼黃原膠、結(jié)冷膠之后第3個(gè)被美國FDA批準(zhǔn)的由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的可食用多糖，我國衛(wèi)生部也于2006年正式批準(zhǔn)該凝膠在部分食品中應(yīng)用。作者從土壤中篩選到一株可以生產(chǎn)可得然膠的根瘤菌（Rhizobiumsp.CGMCC 12099），并對該菌產(chǎn)可得然膠的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以提高其凝膠產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株：江蘇省無錫市龍寺生態(tài)園土壤中篩選獲得，經(jīng)鑒定為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.），中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號為CGMCC 12099。

1.1.2 培養(yǎng)基 苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖20，酵母粉5，蛋白胨5，瓊脂粉20，苯胺藍(lán)0.05，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉 5，蛋白胨 5，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 20，（NH4）2HPO41.5，KH2PO41.0，MgSO40.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO40.02，CoCl2·6H2O 0.01，ZnCl20.01，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的篩選

1.2.1 初篩 篩選所用的土壤樣品分別采集于江蘇省無錫市濱湖區(qū)大浮鎮(zhèn)龍寺生態(tài)園的草叢、湖邊潮濕土壤、樹林茂密的山地土壤。將采集到的不同土壤樣品分別加入到生理鹽水中，梯度稀釋后涂布于苯胺藍(lán)篩選平板，30℃靜置培養(yǎng)2 d，待菌落長出，挑選平板上呈深藍(lán)色的菌株再次在苯胺藍(lán)平板上劃線純化，挑選始終保持深藍(lán)色的單菌落接入30 mL種子培養(yǎng)基中，30℃，120 r/min，培養(yǎng)10 h。

1.2.2 復(fù)篩 將3 mL初篩后的種子菌液接入30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，120 r/min培養(yǎng)60 h，對凝膠產(chǎn)品進(jìn)行提取及鑒定。

1.2.3 菌種鑒定 提取菌株的基因組，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析（由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司完成），得到的測序結(jié)果在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，比較分析與其他菌株的同源性，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，對菌株進(jìn)行分類鑒定[9]。

1.3 產(chǎn)物提取及鑒定

1.3.1 產(chǎn)物提取 取5 mL發(fā)酵液于6 000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入10 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液并振蕩混勻1 h，使得凝膠產(chǎn)品完全溶解在氫氧化鈉溶液中，再次6 000 r/min離心10 min。將上清液用2 mol/L鹽酸中和至pH 6.5～7.0，析出的凝膠和離心后的細(xì)胞沉淀分別用去離子水洗滌3次，80℃烘干至恒重。

1.3.2 熱凝性鑒定及膠強(qiáng)測定 取凍干的凝膠產(chǎn)品0.2 g溶于10 mL去離子水中，充分勻漿后放入18 mm×180 mm的玻璃試管中，沸水浴10 min，然后在冷水中冷卻30 min，觀察凝膠是否具有熱凝性。凝膠強(qiáng)度測定參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.3.3 凝膠產(chǎn)物組分鑒定及紅外圖譜鑒定 將0.1 g凝膠產(chǎn)物的凍干粉與10 mL 1 mol/L的硫酸溶液混合，首先在120℃下水解1 h，后將水解液離心取上清，進(jìn)行第二部水解，條件同第一次。將兩步水解后的凝膠水解液用過量硫酸鋇中和，再離心取上清液。凝膠水解液的組成成分通過液相色譜檢測，所用儀器是 Agilent 1260 Infinity HPLC system（CA，USA），流動相為水相，流量0.5 mL/min，柱溫65℃，進(jìn)樣量10 μL。紅外光譜由傅立葉紅外光譜儀FT/IR-IS10 Nicolet （Thermo，MA，USA） 進(jìn)行檢測，采用溴化鉀壓片法[11]，所用的商品可得然膠購買自Sigma公司。

1.3.4 凝膠產(chǎn)物相對分子質(zhì)量鑒定 凝膠產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量（Mw）檢測采用高效凝膠色譜層析技術(shù)，所用的儀器為高效液相儀（Waters 501，Miliford，MA）， 分離凝膠柱 （Superose 12，10 mm ×300 mm，Pharmacia Inc.）。可得然膠樣品溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，流動相為0.5 mol/L氫氧化鈉，流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。實(shí)驗(yàn)中所用的所有葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖檢測 發(fā)酵液中的葡萄糖殘?zhí)菣z測采用DNS法[12]。

1.4.2 銨根離子檢測 發(fā)酵液中的銨根離子檢測采用次氯酸-水楊酸鈉法[13]。

1.4.3 凝膠產(chǎn)量及細(xì)胞量 凝膠產(chǎn)量及細(xì)胞量檢測通過計(jì)算單位體積發(fā)酵液中凝膠的干質(zhì)量和細(xì)胞干質(zhì)量，方法同1.3.1。

1.4.4 糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算 單位體積發(fā)酵液產(chǎn)膠量（g/L）與消耗的葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L）之比即為糖轉(zhuǎn)化率。

1.5 產(chǎn)可得然膠的搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化

將保存于甘油管中的菌株在平板上劃線活化，然后將單菌落接種于30 mL種子培養(yǎng)基，于30℃，120 r/min培養(yǎng)18 h，然后以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)60 h。所有培養(yǎng)基優(yōu)化都是基于材料方法中的發(fā)酵培養(yǎng)基成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

可得然膠是一種僅由β-1，3糖苷鍵連接而成的葡聚糖，而β-1，3糖苷鍵可以和苯胺藍(lán)試劑特異性結(jié)合而顯藍(lán)色[3]，因此苯胺藍(lán)篩選方法被廣泛用于可得然膠生產(chǎn)菌株的篩選中[14-15]。通過苯胺藍(lán)法對土樣進(jìn)行篩選，從平板上挑選顯深藍(lán)色的菌株，然后進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，根據(jù)已報(bào)道的可得然膠提取方法進(jìn)行產(chǎn)物提取和初步鑒定，最終從87株候選菌株中篩選到一株可以產(chǎn)可得然膠的菌株，該菌株在苯胺藍(lán)平板上顯藍(lán)色（圖1），在固體種子培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)72 h后，菌落呈淺黃色，表面凸起且濕潤。細(xì)胞的革蘭氏染色為陰性，在光學(xué)顯微鏡下觀察呈短桿狀，無芽孢，無鞭毛，圖2為該菌株經(jīng)過結(jié)晶紫染色的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的顯微形態(tài)圖。

采用通用引物擴(kuò)增篩選菌株的16S rDNA片段，經(jīng)測序其長度為1 382 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對顯示，該菌株與Rhizobium radiobacter的同源性最高，達(dá)到99%。選取與目的菌種同源性較高的5株菌，用MEGS 5.0軟件建立系統(tǒng)菌株進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，鑒定菌株與根瘤菌屬均有最高的同源性，并且與Rhizobium radiobacter進(jìn)化親緣關(guān)系最近，結(jié)果與16S rRNA的序列比對結(jié)果一致，進(jìn)一步說明該菌株屬于根瘤菌屬。依據(jù)菌株菌落形態(tài)和16S rDNA序列鑒定，該菌株被鑒定為根瘤菌屬（Rhizobiumsp.），并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號：CGMCC 12099）。

圖1 菌株CGMCC 12099在苯胺藍(lán)平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonies of Rhizobium sp.CGMCC 12099 on aniline blue plate

圖2 菌株CGMCC 12099光學(xué)顯微鏡形態(tài)圖Fig.2 Observation of stain Rhizobium sp.CGMCC 12099 with optical microscope

圖3 篩選菌株（Rhizobium sp.CGMCC 12099）的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of Rhizobium sp.CGMCC 12099

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對凝膠的影響 葡萄糖是合成可得然膠的重要前體物質(zhì)，對培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。隨著培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，可得然膠的產(chǎn)量先增加后下降。在葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，可得然膠產(chǎn)量最高達(dá)到13.8 g/L。在三角瓶中對不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下的可得然膠發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行分析可知（見圖5），在葡萄糖初質(zhì)量濃度為40 g/L培養(yǎng)基中，菌體經(jīng)過8 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，而在糖質(zhì)量濃度為100 g/L的培養(yǎng)基中，菌體在20 h左右才達(dá)到生長穩(wěn)定期，且最終菌濃（1.12 g/L）僅為在40 g/L糖質(zhì)量濃度下的63.5%。在40 g/L初始葡萄糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，葡萄糖平均消耗速率為0.73 g/L/h，是高初始糖質(zhì)量濃度（100 g/L）的1.87倍，說明較高的初糖質(zhì)量濃度對菌體的生長有一定抑制作用。由圖5可知凝膠的快速合成在菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期之后，由于初糖質(zhì)量濃度較高對菌體生長的抑制作用，使得菌體進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間延長，進(jìn)而導(dǎo)致凝膠開始合成時(shí)間延后，在100 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度下凝膠合成較40 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度下延后10 h左右。從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定時(shí)期的菌體濃度對產(chǎn)膠量有較大影響，100 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于40 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度下發(fā)酵產(chǎn)生的凝膠量，最終凝膠產(chǎn)量僅為40 g/L糖質(zhì)量濃度下的57.9%。綜上，高初始葡萄糖質(zhì)量濃度不利于Rhizobiumsp.CGMCC 12099的生長和可得然膠的搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度應(yīng)控制在40 g/L左右。

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度對可得然膠產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of initial glucose on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

2.2.2 氮源的確定及濃度影響 考察了以牛肉浸膏，酵母粉，（NH4）2HPO4，NH4Cl作為唯一氮源時(shí)的凝膠合成情況，如圖6（a）所示。結(jié)果表明，無機(jī)氮源較有機(jī)氮源更有利于凝膠的合成，以（NH4）2HPO4為氮源時(shí)凝膠產(chǎn)量較NH4Cl高，說明磷元素對凝膠的合成也有一定的促進(jìn)作用。可得然膠合成需要的前體物質(zhì)尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）是由尿苷三磷酸（UTP）與葡萄糖合成的[16]，磷元素對UTP的再生起到了重要作用。因此，（NH4）2HPO4的加入不僅為菌體生長提供氮源，還促進(jìn)了可得然膠的合成，繼而對（NH4）2HPO4的添加量進(jìn)行優(yōu)化。可得然膠是典型的次級代謝產(chǎn)物，在氮源限制性條件下開始合成，此后菌體量保持穩(wěn)定[17]，如圖 6（b）所示，可得然膠的合成量隨著培養(yǎng)基中 （NH4）2HPO4質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的變化。當(dāng)（NH4）2HPO4質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，凝膠產(chǎn)量為14.2 g/L達(dá)到最高，此時(shí)糖轉(zhuǎn)化率（66.7%）也達(dá)到最高。

圖5 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下可得然膠搖瓶發(fā)酵時(shí)間進(jìn)程曲線Fig.5 Time course of curdlan fermentation by Rhizobium sp.CGMCC 12099 under different initial glucose concentrations

2.2.3 無機(jī)鹽對凝膠產(chǎn)量的影響 無機(jī)鹽是菌體細(xì)胞生長代謝不可或缺的成分，考察了MgSO4和KH2PO4兩種無機(jī)鹽的影響，結(jié)果如圖7所示。MgSO4和KH2PO4在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度對凝膠產(chǎn)量有較明顯地影響，鎂鹽質(zhì)量濃度在1 g/L時(shí)為最佳。KH2PO4不僅為菌體生長代謝提供鉀元素和磷元素，磷酸二氫根還能在發(fā)酵液pH的緩沖和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定的作用，單因素優(yōu)化結(jié)果顯示KH2PO4的最佳質(zhì)量濃度為1.5 g/L。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)。因素水平見表1，4因素分別為葡萄糖 （A），（NH4）2HPO4（B），KH2PO4（C），MgSO4（D）。 正交優(yōu)化結(jié)果見表 2-3。

圖6 發(fā)酵培養(yǎng)基中不同氮源種類和添加量對可得然膠產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources and amount of （NH4）2HPO4on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

圖7 MgSO4和KH2PO4質(zhì)量濃度對凝膠合成的影響Fig.7 Effects of MgSO4and KH2PO4on curdlan production and glucose conversion rate by Rhizobium sp.CGMCC 12099

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental variables and levels for orthogonal optimization experiment design

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析和方差分析顯示，影響凝膠產(chǎn)量的主次順序：葡萄糖 >（NH4）2HPO4>KH2PO4>MgSO4，最優(yōu)組合為：葡萄糖 50 g/L，（NH4）2HPO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.25 g/L。對得到的最優(yōu)培養(yǎng)基方案進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證，通過對可得然膠發(fā)酵過程中菌體質(zhì)量濃度、可得然膠質(zhì)量濃度和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的監(jiān)測，得到了可得然膠的發(fā)酵進(jìn)程曲線，如圖8所示。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，可得然膠的平均產(chǎn)量為23.1 g/L，較優(yōu)化前提高了29.2%，糖轉(zhuǎn)化率為62.6%，較優(yōu)化前提高了5.4%，說明正交優(yōu)化得出的工藝條件有效可行。

圖8 最優(yōu)培養(yǎng)基條件下可得然膠搖瓶發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.8 Time course of curdlan fermentation by Rhizobium sp.CGMCC 12099 in flasks

2.3 凝膠產(chǎn)物性質(zhì)分析

根據(jù)可得然膠的理化特性，作者對凝膠產(chǎn)物的熱凝性、凝膠強(qiáng)度、分子組成和紅外光譜進(jìn)行檢測。將20 g/L的凝膠產(chǎn)品懸濁液加熱后，產(chǎn)品形成了有彈性的膠狀固體，經(jīng)過膠強(qiáng)檢測，該產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度為229 g/cm2。凝膠產(chǎn)品水解液經(jīng)過液相分析顯示，該多聚糖僅由葡萄糖組成。利用凝膠色譜層析測得凝膠產(chǎn)品的平均相對分子質(zhì)量為1.4×105，與文獻(xiàn)中報(bào)道的可得然膠相對分子質(zhì)量5.3×104～2.0×106相符合[18]。通過對比紅外光譜圖可以發(fā)現(xiàn)，凝膠產(chǎn)品的紅外光譜圖與可得然膠商品的光譜圖一致。如圖9所示，圖中890 cm-1處有峰而在840 cm-1無峰，說明凝膠產(chǎn)物中僅有β-1，3糖苷鍵而沒有α型糖苷鍵[19]；3 410 cm-1和2 924 cm-1處的峰分別顯示樣品中的O—H基團(tuán)和C—H基團(tuán)；在1 075 cm-1處的峰是C—O基團(tuán)的特征峰，與文獻(xiàn)中報(bào)道的紅外檢測圖譜一致[20]。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Design and results of orthogonal optimization experiment

表3 可得然膠產(chǎn)量方差分析Table 3 Variance analysis for curdlan production

圖9 凝膠產(chǎn)品與可得然膠商品的紅外光譜圖Fig.9 FT/IR spectra of the polysaccharide obtained in this study and the commercial curdlan sample

3 結(jié) 語

采用苯胺藍(lán)顯色平板篩選方法，從土壤中篩選到一株產(chǎn)可得然膠的根瘤菌（Rhizobiumsp.CGMCC 12099），并對該凝膠產(chǎn)品的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析和鑒定。基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)的方法，對該菌株生產(chǎn)可得然膠的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定產(chǎn)可得然膠的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖50 g/L，（NH4）2HPO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.25 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO40.02 g/L，CoCl2·6H2O 0.01 g/L，ZnCl20.01 g/L。對所得到的優(yōu)化方案進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證結(jié)果顯示，優(yōu)化后的可得然膠產(chǎn)量達(dá)到23.1 g/L，較優(yōu)化前提高29.2%，糖轉(zhuǎn)化率為62.6%，較優(yōu)化前提高了5.4%。