凝血因子VII高表達(dá)細(xì)胞的高通量篩選方法

彭 林， 李成媛， 熊文典， 蔡燕飛， 金 堅(jiān)， 李華鐘*

（1．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122）

自1987年第一款重組蛋白藥物人組織纖溶酶原激活劑（tPA）批準(zhǔn)銷售，至今已有超過200種重組蛋白藥物用于治療多種疾病，包括單克隆抗體、激素、生長因子和其他融合蛋白[1]。同時(shí)重組蛋白藥物的銷售利潤也在2012年超過1 600億美元，這顯示了重組藥物蛋白龐大的市場前景[2]。目前，多種表達(dá)宿主用于表達(dá)生產(chǎn)重組藥物蛋白，如原核細(xì)胞的大腸桿菌和簡單真核細(xì)胞的酵母等。重組藥物蛋白主要用于人類疾病的治療，而表達(dá)宿主的差異可能由于蛋白合成過程中翻譯后修飾方面的差異，從而導(dǎo)致在臨床使用中引起毒副作用[3]，因此具有和人相近的哺乳動(dòng)物細(xì)胞成為越來越多藥物蛋白的表達(dá)宿主。較為常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK）等，而 CHO 細(xì)胞具有成熟的無血清培養(yǎng)體系和大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)手段，其生產(chǎn)的重組藥物蛋白更易通過FDA的批準(zhǔn)[4-5]。

利用CHO細(xì)胞表達(dá)重組藥物蛋白，在轉(zhuǎn)入目的蛋白編碼基因后需要通過基因缺陷或抗性標(biāo)記等方法，從中選出陽性高表達(dá)克隆，目前主要采用二氫葉酸還原酶基因缺陷型CHO細(xì)胞或帶有抗性的質(zhì)粒進(jìn)行篩選[6]。傳統(tǒng)方法中需要將轉(zhuǎn)入基因的細(xì)胞稀釋后貼壁生長于平板中，單一細(xì)胞在相應(yīng)環(huán)境生長后檢測重組蛋白表達(dá)量后進(jìn)行挑選。雖然此方法可獲得重組藥物蛋白的表達(dá)細(xì)胞系，但挑選過程需要人工完成并耗時(shí)較長，為獲得較純的單一細(xì)胞系依賴于個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。作者在構(gòu)建表達(dá)重組凝血因子七（rFVII）的過程中，利用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)入fvii基因的CHO細(xì)胞分選并檢測，同時(shí)將最終獲得的rFVII表達(dá)克隆與傳統(tǒng)方法下獲得克隆進(jìn)行比較，探討該方法的可行性，建立快速高通量的篩選方法并其他重組藥物蛋白表達(dá)細(xì)胞提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 pMH3質(zhì)粒和中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO-K1）購自杭州AmProtein公司，含有FVII編碼基因的pINC9-rFVII質(zhì)粒由蘇州大學(xué)提供。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶NotI和EcoR I：Ferments公司產(chǎn)品；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）：Gibco 公司產(chǎn)品； 無血清培養(yǎng)基 B001：AmProtein公司產(chǎn)品；山羊抗人FVII抗體：Cedarlane Labs公司產(chǎn)品；rFVII Elisa檢測試劑盒：Assaypro公司產(chǎn)品；Alexa Fluor 488兔抗山羊二抗：Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切驗(yàn)證 將FVII編碼基因利用設(shè)計(jì)引物通過PCR方法獲得兩段分別為NotI和EcoR I酶切位點(diǎn)的基因序列，酶切后連接于pMH3獲得pMH3/rFVII，構(gòu)建的質(zhì)粒酶切后在1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。同時(shí)，pMH3/rFVII送至上海生工進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.2 細(xì)胞分選 在MoFlo XDP流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）中，以PBS溶液為流動(dòng)相，通過設(shè)定96孔板每孔不同細(xì)胞數(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選，分選后的96孔板每孔含有200 μL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)2周，統(tǒng)計(jì)每個(gè)96孔板中含有細(xì)胞生長的孔數(shù)。

1.2.3 構(gòu)建并篩選rFVII表達(dá)細(xì)胞 通過電轉(zhuǎn)方法將rFVII編碼基因轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)反應(yīng)體系（200 μL）：3×106個(gè) CHO 細(xì)胞、20 μg 質(zhì)粒、10 μg鮭魚精DNA，電轉(zhuǎn)條件為400 V、500 μs條件電擊3次。電轉(zhuǎn)后細(xì)胞在1.8 mg/mL G418篩選后經(jīng)流式細(xì)胞儀分選至96孔板，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)2周后用于免疫印跡檢測。通過點(diǎn)雜交篩選96孔板中分選的細(xì)胞后，將高表達(dá)克隆轉(zhuǎn)至24孔板培養(yǎng)并利用Western Blot（WB）檢測，最終獲得rFVII的CHO表達(dá)細(xì)胞。

1.2.4 免疫印跡檢測 點(diǎn)雜交：將96孔板中的培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基B001生長2 d，在PVDF膜滴加5 μL待檢測樣品，烘干后利用脫脂牛奶封閉，用TBST清洗后加入FVII抗體稀釋液 （利用TBST以1∶3 000比例稀釋），室溫孵育3 h，經(jīng)TBST清洗3次，每次15 min，最后利用化學(xué)發(fā)光顯色液ECL進(jìn)行顯色檢測。WB：將樣品經(jīng)10 g/dL SDS-PAGE凝膠分離后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)至PDVF膜中，轉(zhuǎn)膜條件為100 V電壓、400 mA電流下1 h，PDVF膜經(jīng)封閉和孵育FVII抗體后由ECL顯色，具體過程與點(diǎn)雜交相同。

1.2.5 rFVII表達(dá)細(xì)胞的純度檢測 將細(xì)胞消化重懸后利用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液清洗后質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%Triton通透10 min，PBS溶液清洗后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSA中封閉30 min，PBS清洗后PBS以體積比1∶3 000比例稀釋的FVII抗體室溫孵育 2 h，PBS溶液清洗后利用 Alexa Fluor 488兔抗山羊二抗孵育1 h，PBS溶液清洗后利用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 懸浮培養(yǎng) 將rFVII表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)至T75培養(yǎng)瓶中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基、37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)2 d，消化后離心去除培養(yǎng)基并用20 mL無血清培養(yǎng)基于T75培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)2 d，細(xì)胞經(jīng)離心后以1×106個(gè)/mL濃度接種至250 mL三角瓶中用B001培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、100 r/min。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中不同時(shí)間的細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，利用血球板計(jì)算其中活細(xì)胞數(shù)目。rFVII濃度通過Elisa試劑盒（Assaypro公司）檢測，檢測方法依照試劑盒說明書。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

以pINC9-rFVII質(zhì)粒為模板，通過PCR方法獲得兩側(cè)分別為NotI和EcoR I酶切位點(diǎn)的基因片段，將片段與pMH3質(zhì)粒酶切后連接，最終獲得表達(dá)質(zhì)粒pMH3/rFVII，表達(dá)質(zhì)粒分別通過酶切驗(yàn)證（圖1）和測序，最終確定所獲得的pMH3/rFVII與設(shè)計(jì)一致，用于后續(xù)電轉(zhuǎn)。

圖1 pMH3/rFVII質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of plasmid pMH3/rFVII by double enzymatic digestion

2.2 細(xì)胞分選條件的設(shè)定

MoFlo XDP流式細(xì)胞儀在使用中可以設(shè)定96孔板中每孔細(xì)胞數(shù)，設(shè)置每孔分選細(xì)胞數(shù)可以顯著影響細(xì)胞在96孔板中的生長，較小的細(xì)胞數(shù)設(shè)定導(dǎo)致生長細(xì)胞的孔數(shù)較為明顯的下降。96孔板中生長有細(xì)胞的孔數(shù)一方面受儀器的限制無法使所有96孔板分選到細(xì)胞，另一方面可能分選加入的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中死亡，因此需要調(diào)整流式細(xì)胞儀的設(shè)定從而保證篩選樣品的范圍，每孔過多的細(xì)胞數(shù)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞純度的下降，最終影響rFVII的表達(dá)量。綜合考慮上述兩種因素，最終選擇以每孔3細(xì)胞條件進(jìn)行細(xì)胞的分選。

2.3 點(diǎn)雜交篩選高表達(dá)克隆

將電轉(zhuǎn)后經(jīng)過G418篩選的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于點(diǎn)雜交檢測，結(jié)果見圖2。細(xì)胞分選中將細(xì)胞分選至6塊96孔板中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)雜交結(jié)果中可被檢測到rFVII的孔數(shù)與表1中結(jié)果相近。通過比較點(diǎn)雜交結(jié)果中每塊96孔板中表達(dá)量，從每塊96孔板中挑選表達(dá)量較高的克隆。點(diǎn)雜交方法的原理與WB相同，但可同時(shí)檢測的樣品數(shù)遠(yuǎn)高于WB，因此首先利用點(diǎn)雜交方法對分選后細(xì)胞進(jìn)行初步檢測，從中選出表達(dá)量相對較高的細(xì)胞用于后續(xù)WB進(jìn)一步檢測。

圖2 點(diǎn)雜交篩選rFVII高表達(dá)克隆Fig.2 Screening high rFVII expression clones by dot blot

2.4 WB篩選高表達(dá)克隆

將點(diǎn)雜交篩選得到的rFVII表達(dá)量較高克隆轉(zhuǎn)至24孔板生長后，其無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的上清液進(jìn)行WB檢測，結(jié)果見圖3。rFVII相對分子質(zhì)量為50 000，與WB檢測結(jié)果中顯示的條帶相對分子質(zhì)量抑制。通過WB方法的檢測，將不同96孔板挑選出的細(xì)胞進(jìn)行比較，最終確定9個(gè)克隆中a2克隆具有較高的表達(dá)量。由于上述方法采用每孔3個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分選，經(jīng)點(diǎn)雜交、WB篩選得到的細(xì)胞并非純細(xì)胞，因此需要再重復(fù)上述分選、點(diǎn)雜交、WB進(jìn)一步檢測，最終得到CHO-rFVII-1細(xì)胞用于后續(xù)懸浮無血清發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖3 WB篩選rFVII高表達(dá)克隆Fig.3 Screening high rFVII expression clones by WB

2.5 rFVII表達(dá)克隆的純度檢測

為考察流式細(xì)胞儀分選方法篩選獲得的克隆純度，將細(xì)胞標(biāo)記帶有綠色熒光標(biāo)記后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。蛋白在合成過程中需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯和修飾等過程，因此少量rFVII存在于胞內(nèi)并可與FVII抗體結(jié)合，經(jīng)過帶有熒光蛋白的二抗標(biāo)記后可通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。作者在之前的研究中考察了單獨(dú)加一抗或二抗抗體后的細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其并未有熒光蛋白標(biāo)記，而不同純度的克隆可通過該方法進(jìn)行區(qū)分并定量。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)入構(gòu)建質(zhì)粒的CHO細(xì)胞與分選方法獲得的CHO-rFVII-1細(xì)胞可明顯區(qū)分，同時(shí)CHO-rFVII-1細(xì)胞中可合成rFVII的陽性克隆占99.9%以上。

圖4 CHO-rFVII-1細(xì)胞中表達(dá)rFVII細(xì)胞的比例Fig.4 Percentage of positive cells expressing rFVII in CHO-rFVII-1

2.6 懸浮培養(yǎng)表達(dá)rFVII

在經(jīng)過上述篩選過程后獲得rFVII表達(dá)細(xì)胞CHO-rFVII-1后，將傳統(tǒng)方法篩選獲得的CHO-rFVII細(xì)胞作為對照，從rFVII表達(dá)量和細(xì)胞生長兩方面進(jìn)行比較。在無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的條件下發(fā)酵6 d，rFVII表達(dá)量和細(xì)胞密度結(jié)果見圖5。細(xì)胞密度在250 mL三角瓶中培養(yǎng)時(shí)在第3天達(dá)到最高，之后開始下降，而rFVII濃度隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸積累，在發(fā)酵結(jié)束的第6天達(dá)到最高。與對照相比，利用流式細(xì)胞儀分選方法獲得rFVII表達(dá)細(xì)胞在細(xì)胞生長和rFVII表達(dá)方面并無明顯差別，表明流式細(xì)胞儀分選方法在實(shí)際操作中具有可行性。

圖5 無血清懸浮培養(yǎng)中CHO-rFVII和CHO-rFVII-1的活細(xì)胞密度（a）和rFVII質(zhì)量濃度（b）Fig.5 Viable cell density （a） and rFVII concentration of CHO-rFVII and CHO-rFVII-1 during suspension culture with serum-free medium

3 結(jié) 語

近年來，越來越多的重組藥物蛋白選擇利用CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)[1，7]。在構(gòu)建和篩選生產(chǎn)細(xì)胞的過程中，需要利用基因缺陷型或表達(dá)質(zhì)粒帶有的抗性標(biāo)記進(jìn)行挑選，同時(shí)利用免疫印跡方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，從而選擇高表達(dá)克隆。目前廣泛采用的基因缺陷型CHO細(xì)胞為早期構(gòu)建的二氫葉酸脫氫酶基因缺陷細(xì)胞，即CHO-DUKX細(xì)胞[6]。為獲得高表達(dá)克隆，可通過增加電轉(zhuǎn)時(shí)體系中的質(zhì)粒和抗生素添加量等方法提高細(xì)胞中目的基因的拷貝數(shù)，從而達(dá)到提高重組蛋白表達(dá)量的目的[8]。但在整個(gè)挑選高表達(dá)細(xì)胞的過程中，由于細(xì)胞處于貼壁培養(yǎng)的狀態(tài)，最為耗時(shí)的步驟為將稀釋后生長于平板中的細(xì)胞挑選至96孔板，同時(shí)該過程較為依賴人工經(jīng)驗(yàn)，因此很難再較短的時(shí)間內(nèi)挑選克隆的數(shù)量并保證克隆的純度。為解決這一問題，一些研究者將細(xì)胞培養(yǎng)于半固體培養(yǎng)基中，使細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白集中在細(xì)胞周圍，利用帶有熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測后進(jìn)行篩選[7]。此方法與傳統(tǒng)方法不同之處在于可在平板中培養(yǎng)后直接挑選高表達(dá)克隆，但仍需進(jìn)一步檢測和驗(yàn)證不同克隆之間的表達(dá)量，同時(shí)在培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測仍存在較大誤差。此外，還有研究者將綠色熒光蛋白（GFP）通過基因構(gòu)建的手段與目的蛋白共同表達(dá)，通過胞內(nèi)表達(dá)GFP是陽性克隆帶有標(biāo)記從而進(jìn)行分選[9-10]。作者建立的方法，還可以應(yīng)用于其他重組蛋白和重組融合蛋白表達(dá)克隆的篩選。

通過考察不同分選條件后，確定以每孔2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分選可同時(shí)達(dá)到較大篩選范圍和較高細(xì)胞純度的目的，利用點(diǎn)雜交和WB方法進(jìn)行兩次篩選后可得到rFVII高表達(dá)克隆。在利用熒光抗體標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀檢測得到克隆的純度后發(fā)現(xiàn)，該克隆全部為rFVII表達(dá)細(xì)胞，同時(shí)與傳統(tǒng)方法得到的rFVII表達(dá)細(xì)胞具有相同的細(xì)胞生長和rFVII表達(dá)特性，表明該方法可實(shí)現(xiàn)與傳統(tǒng)篩選方法相同的篩選結(jié)果。與傳統(tǒng)方法相比，細(xì)胞分選方法在挑選細(xì)胞時(shí)具有高通量、節(jié)省時(shí)間和排除人工經(jīng)驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于rFVII表達(dá)細(xì)胞的篩選，對CHO和其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組藥物蛋白的篩選工作具有借鑒意義。