響應面法優化彈簧糊精的酶解制備工藝

閔丹丹， 徐學明， 焦愛權， 潘小衛， 金征宇

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

彈簧糊精是由葡萄糖單元由α-（1→4）糖苷鍵連接而成的線性，多分散性的多糖，因其柔性螺旋結構像彈簧一樣具有可逆的拉伸和松弛特性而得名[1]。彈簧糊精的特殊結構，使其在淀粉抗老化，包埋活性物質以及手性分離方面展現了廣闊的應用前景[1～5]。

彈簧糊精的制備方法主要有酶法合成和酶法分解。酶法合成反應成本高，反應工藝復雜，難以進行工業化生產。2012年，徐等[6]采用α-淀粉酶酶解直鏈淀粉制備彈簧糊精，在制備過程中，需要對支鏈淀粉和直鏈淀粉進行分離，這使得加工過程變得繁瑣。并且由于α-淀粉酶作用位點隨機，產物聚合度分布廣，且產率較低。

Tokuya等[7]使用凝膠排阻層析法分析普魯蘭酶對支鏈淀粉的剪切方式，發現普魯蘭酶首先是從外側水解支鏈淀粉，而普魯蘭酶水解物中只有聚合態支鏈淀粉和線性葡聚糖，即彈簧糊精。并且，普魯蘭酶專一水解α-（1→6）糖苷鍵。采用普魯蘭酶制備彈簧糊精的反應過程容易控制，產物聚合度較為集中。由于蠟質玉米淀粉幾乎全部為支鏈淀粉，直鏈淀粉很少，選其為原料，可以省去繁瑣的分離步驟。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質玉米淀粉：杭州普羅星淀粉有限公司產品；普魯蘭酶（1 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司產品；配有多角度激光光散射儀檢測器和示差檢測器的凝膠色譜系統（HPSEC-MALLS-RI檢測系統）：美國Wyatt公司產品；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海柏欣儀器設備廠產品；Dionex ICS-5000高效陰離子交換色譜系統 （HPAECPAD）：美國戴安公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 彈簧糊精的制備 準確稱取5 g蠟質玉米淀粉，加入90 mL去離子水，在沸水浴中攪拌15 min，使其預糊化，再于121℃條件下高壓處理15 min，使其徹底糊化，冷卻至室溫后，加入5 mL一定pH值的醋酸鈉緩沖溶液，再加入一定體積的普魯蘭酶，然后放入一定溫度的水浴鍋中震蕩一段時間；將完成上述酶解反應的溶液煮沸，冷卻后在離心機中以5 000 r/min的速度離心10 min，除去變性酶，取上清液旋轉蒸發濃縮后60℃度烘干，即得彈簧糊精粗品。

1.2.2 彈簧糊精相對分子質量信息的測定 使用HPSEC-MALLS-RI檢測系統對彈簧糊精樣品的平均相對分子質量和相對分子質量分布進行測定[8]。流動相為0.3 mol/L NaNO3溶液 （含有質量分數0.02%的NaN3），經0.45 μm的濾膜過濾后，超聲 30 min；流動相流量0.5 mL/min，流動相折光指數為1.331，進樣量 200 μL，柱溫 50 ℃，折光指數增量（dn/dc）為0.147。采用Astra軟件對激光散射信號和示差折光檢測器信號進行采集、分析和計算。

取25～30 mg彈簧糊精粗品，溶解于3 mL流動相溶液中，經0.45 μm濾膜過濾后進樣。

1.2.3 彈簧糊精聚合度分布的測定 使用配有ED-40型脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜（HPAEC-PAD）對彈簧糊精的鏈長分布進行檢測[9-10]。色譜柱型號為戴安CarboPAC PA200。流動相：100 mmol/L NaOH（A），100 mmol/L NaOH+600 mmol/L NaAC（B）。采用線性梯度洗脫：0 min時為體積分數20%的洗脫液B，在60 min時為體積分數100%的洗脫液B。流量為1 mL/min，進樣量25 μL。將彈簧糊精溶于去離子水后加熱溶解，配成3 mg/mL的溶液，過0.25 μm的濾膜后進樣。

1.2.4 彈簧糊精純度的計算 圖1為使用HPSECMALLS-RI檢測系統所測出的普魯蘭酶酶解蠟質玉米淀粉不同時間所得到的酶解產物的相對分子質量分布。peak1和peak2是普魯蘭酶酶解蠟質玉米淀粉所得線性葡聚糖（即彈簧糊精）的相對分子質量分布（1 200～18 000），此結果與 Cai等[11]使用異淀粉酶酶解蠟質玉米淀粉所得線性葡聚糖的相對分子質量分布相近，peak3代表未被徹底酶解的聚合態支鏈淀粉。

式中：S1為peak1的面積；S2為peak2的面積；S3為peak3的面積。

圖1 普魯蘭酶酶解蠟質玉米淀粉不同時間所得產物的相對分子質量分布Fig.1 Mw distribution of products from waxy corn starch debranched by pullulanase at different times

1.2.5 響應面試驗設計 根據單因素實驗，采用Box-Behnken設計，以彈簧糊精純度（Y）為響應值，對溫度、pH、時間、酶用量進行優化，因素水平表見表1。

1.2.6 數據處理 采用Design-Expert v8.0.6.1軟件進行實驗數據處理、分析，采用Origin 8.5軟件進行繪圖。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Coded values of the variables for the Box-Behnken design

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對彈簧糊精純度的影響 根據預實驗，設定pH為5.1，酶添加量400 U/g，酶解時間5 h，研究溫度分別為 45、50、55、60、65 ℃時， 溫度對彈簧糊精純度的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，當溫度在45～55℃之間時，彈簧糊精的純度隨著溫度的升高而增加。這主要是在溫度低于55℃時，普魯蘭酶的活性隨著溫度的升高而逐漸增強，反應速度逐漸加快。當溫度繼續升高時，普魯蘭酶部分失活，彈簧糊精的純度會有所下降。溫度在50～60℃之間時，彈簧糊精的純度均較高；溫度為55℃時，彈簧糊精的純度最高。所以50～60℃為普魯蘭酶作用的適宜溫度范圍，選則55℃作為最適反應溫度。

圖2 溫度對彈簧糊精純度的影響Fig.2 Effect of temperature on purity of spring dextrin

2.1.2 pH對彈簧糊精純度的影響 根據預實驗，設定溫度為55℃，酶添加量400 U/g，酶解時間5 h，研究 pH 分別為 4.3、4.7、5.1、5.5、5.9 時，pH 對彈簧糊精純度的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，當pH小于4.7時，彈簧糊精的純度會隨著pH的提高而顯著增加；當pH高于5.1時，彈簧糊精的純度呈下降趨勢。這說明普魯蘭酶的活性會受到pH的顯著影響；普魯蘭酶在pH4.7～5.1時，能快速水解α-（1→6）糖苷鍵，產生較多的彈簧糊精。在pH 5.1時，彈簧糊精的純度最高，故選擇pH 5.1為最適反應pH。

圖3 pH對彈簧糊精純度的影響Fig.3 Effect of pH on the purity of spring dextrin

2.1.3 酶用量對彈簧糊精純度的影響 根據預實驗，設定溫度為55℃，pH 5.1，酶解時間5 h，研究酶用量分別為 50、200、300、400、500、600 U/g 時，酶用量對彈簧糊精純度的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，當酶用量小于300 U/g時，隨著酶添加量的增加，彈簧糊精的純度逐漸增加，兩者呈線性關系。這說明底物未被酶所飽和，反應速度主要取決于酶添加量。當酶用量大于400 U/g時，彈簧糊精的純度隨酶用量的增加而增長緩慢，從經濟角度和彈簧糊精純度綜合考慮，作者選擇的最佳酶用量為400 U/g。

圖4 酶用量對彈簧糊精純度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the purity of spring dextrin

2.1.4 時間對彈簧糊精純度的影響 根據預實驗，設定溫度為55℃，pH 5.1，酶用量 400 U/g，研究酶解時間分別為 1、2、3、4、5、6 h 時，酶解時間對彈簧糊精純度的影響，結果如圖5所示。

由圖5可知，時間在5 h前，彈簧糊精的純度隨著時間的延長呈增加趨勢；當時間繼續延長，彈簧糊精的純度增長緩慢，基本趨于穩定。這是因為支鏈淀粉具有不同長度的支鏈，普魯蘭酶能較快地水解以α-（1→6）糖苷鍵連接的短鏈葡聚糖；隨著反應時間的延長，普魯蘭酶只能以極慢的速度水解還未被水解的長鏈葡聚糖[12]。因此，作者選擇5 h為最佳酶解時間。

圖5 時間對彈簧糊精純度的影響Fig.5 Effect of time on the purity of spring dextrin

2.2 響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果 Box-Behnken試驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續表2

2.2.2 響應面模型的選擇 由表3知，一階線性模型和二因素交互關系模型的失擬項P值均小于0.01，為極顯著，表示這兩個模型出現失誤的概率比較大，不適宜進行數據擬合；二階模型和三階模型的失擬項P值都大于0.05，但是三階模型的序變模型P值大于0.05，為不顯著，說明采用三階模型容易出現混雜的模型[13]。二階模型的R2=0.908 8，表示該模型能夠解釋90.88%的總變異，僅有9.12%的變異無法用該模型解釋[14]。綜上所述，采用二次模型進行彈簧糊精制備預測是切實可行的。

表3 模型擬合概要Table 3 Model fit summary

2.2.3 二次模型建立與顯著性檢驗 對表2結果進行回歸分析，擬合的溫度（X1）、時間（X2）、酶用量（X3）、pH（X4）對彈簧糊精純度（Y）影響的二次回歸方程為：

響應值二次模型的方差分析及顯著性如表4所示。由表4可以看出，模型P＜0.000 1，模型達到極顯著。失擬項P=0.050 5＞0.05不顯著，因此該二次模型擬合度良好。

其中一次項X1、X3、X4均顯著，X2不顯著； 二次項X1、X3、X4顯著，其他不顯著，交互項X1X4和X2X3顯著，所以得出影響彈簧糊精純度的因素依次：pH值＞酶用量＞溫度＞時間。

通過分析計算得到酶法制備彈簧糊精的最優條件為：酶解pH 4.96，酶解溫度53.32℃，酶解時間6 h，酶用量420 U/g淀粉，彈簧糊精純度預測值為99.4%，經驗證試驗，在該實驗條件下得到的彈簧糊精純度為99.2%。與預測值基本一致，說明該方程與實際情況相符合，擬合程度較好。

表4 響應值二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

2.3 彈簧糊精鏈長分布情況

圖6是采用HPSEC-MALLS-RI檢測系統所測出的彈簧糊精分子量信息，可知彈簧糊精的相對分子質量分布為1 200～18 000，其中相對分子質量小于 9 720（DP＜60）的彈簧糊精占 95.5%。 HPAEC 可用來測定聚合度在6～60之間的葡聚糖[15]，所以可采用HPAEC測定絕大部分彈簧糊精的聚合度分布，結果如圖7所示。根據聚合度差異，將彈簧糊精分為 4 組[16]，即DP 6～12，13～24，25～36，37～60，它們所占的比例分別為24.40%，45.08%，19.60%，10.92%。

圖6 彈簧糊精的相對分子質量分布Fig.6 Molecular weight distribution of spring dextrin

圖7 彈簧糊精的聚合度分布Fig.7 Degree of polymerization distribution of spring dextrin

3 結語

作者通過響應面實驗對酶解工藝參數進行優化，以期對蠟質玉米淀粉脫支完全，實現彈簧糊精的較高得率。