羧甲基賴氨酸在方便面中含量及其對雄性生殖和胚胎發育毒性的研究

孫建霞， 文羅娜， 張振華， 朱翠娟， 歐仕益， 白衛濱*

（1.廣東工業大學 輕工化工學院，廣東 廣州 510090；2.暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

晚期糖基化終末產物 （Advanced glycationend products，AGEs）是指在非酶促條件下，蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離氨基與還原糖（葡萄糖、果糖、戊糖等）C的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產生的一組穩定的終末產物[1]。AGEs分為內源性和外源性兩類，內源性AGEs由生物體內的蛋白質和糖類發生糖化反應產生，在高血糖或腎功能衰竭時易形成[2]；外源性AGEs則由人體從外部攝入[1]，其中大部分經膳食攝入，即食源性AGEs[3]。

過度攝入高AGEs的飲食會增強氧化應激、炎癥發應，并引發糖尿病及其并發癥，如傷口的愈合，AGEs的積累還與阿爾茲海默并和動脈粥樣硬化有關[3-5]。 羧甲基賴氨酸（Nε-（carboxymethyl） lysine，CML）是第一個從食品（牛奶和奶制品）中鑒定出的AGEs單體，并被證實為各類日常食品中最為主要的一種AGEs，在食品加工和加熱過程中均有生成，且在生物體內分布廣泛。因此，CML常作為研究生物體內和食品中AGEs類物質的代表性研究對象[6]。研究表明，CML是AGEs的主要抗原表位，并在糖尿病及其并發癥，以及衰老的發生和發展過程中起重要作用[7]。CML潛在的危害性已越來越受到食品科技界、醫學界的廣泛關注。膳食的AGE和內生的AGE會產生協同作用，導致系統糖氧化負擔、氧化壓力和細胞活化，增加靶組織對的易損性，危害機體健康[8]，但是尚無文獻報道CML對于雄性生殖和胚胎發育的影響。

方便面基質中，CML是以兩種形式存在，即游離態和結合態，相比結合態CML，游離態CML的生物相容性更高，更容易進入血清，所以游離態CML對機體危害更大[9]。目前根據儀器、樣品基質、及預處理方法的不同，較為有效地測定CML的方法有酶聯免疫吸附測定法 （Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[10]、氣相色譜串聯質譜法[11]、液相色譜串聯質譜法[12]等。Uribarri等采用酶聯免疫法對日常食用的549種食品中CML進行了檢測[13]。相比HPLC-MS/MS、GC-MS等分析法，酶聯免疫法不需衍生、固相萃取等繁復的前處理，操作簡單、快速，故作者采用酶聯免疫法對方便面中的CML進行了分析。

以不同的前處理方式，結合酶聯免疫分析法分別檢測方便面中兩種形態的CML的含量，并通過體外細胞培養評價CML的雄性生殖毒性和胚胎發育毒性。目前尚無關于CML或其他AGEs的雄性生殖或胚胎發育毒性報道。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇，硼氫化鈉，三氯乙酸，正己烷，二甲基亞砜（分析純）：購于天津大茂化學試劑公司；CML標準品 （純度≥98%）：購于百靈威公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、 馬血清： 購于 Gibco 公司；F12 培養基、Dulbecco's modified eagle medium（DMEM）培養基、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），血清替代物KSR：購于Life公司；R2C細胞：購于中國典型培養物保藏；3T3細胞、D3細胞：購于中山大學細胞庫；C57小鼠：購于中山大學實驗動物中心；CML試劑盒：購于南京森貝伽生物科技有限公司；放射免疫測定孕酮試劑盒：購于北京化學研究所；噻唑藍 （MTT），購于Amresco公司；方便面：廣州市售產品。

小型粉碎機：廣州興榮機械有限公司產品；低速離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司產品；自動酶標儀：北京普天新橋技術有限公司產品。

1.2 標準曲線的制備

根據CML試劑盒說明書制備標準曲線。酶標包被板上設標準品孔10孔，兩孔為一平行組，以60 μg/L的標準品溶液為母液分別在孔板依次稀釋，最終得濃度分別為 60、40、20、10、5 μg/L，并加設空白對照組。然后將酶標板在37℃進行30 min溫浴，在經歷洗滌，加酶，顯色等一系列操作后，將其置于酶標儀在450 nm處進行A值測定，并以空白對照進行調零。最終以標準品濃度為橫坐標，以OD值為橫坐標得標準曲線

y=0.000 5x2+0.001 1x+0.014 1，R2=0.999 1。

1.3 樣品檢測

游離態CML的檢測：稱取4.00 g研磨后的方便面樣品置于50 mL離心管中，配制體積分數70%甲醇溶液，按料液質量體積比為1 g∶9 mL比例加入甲醇溶液萃取樣品，用強力震蕩器震蕩樣品3 min，然后以3 000 r/min速度對樣品進行離心，取上清液，依照說明書進行酶聯免疫分析。

結合態CML的檢測：稱取1.00 g研磨粉碎后的樣品置于50 mL離心管中。加入10 mL正己烷，充分渦旋，于10 000 r/min離心3 min，棄正己烷層，重復上述正己烷脫脂過程2次，氮吹（40℃）揮去正己烷。向脫脂后的樣品中加入5 mL、0.2 mol/L的硼酸鹽緩沖液，渦旋混勻，加入2 mol/L硼氫化鈉溶液渦旋混勻，使硼氫化鈉溶液的終濃度為0.1 mol/L，4℃，過夜。還原后的樣品中加入60%的三氯乙酸溶液使其終濃度為20%，混勻，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，待水解。將沉淀的蛋白質物質轉移至100 mL的具塞比色管中，加入20 mL、6 mol/L的HCL溶液，混勻，110℃水解24 h；水解液冷卻至室溫，用水定容至50 mL，濾紙過濾，收集濾液。取1mL濾液，用0.5 mol/L的NaOH溶液調節體系pH至中性。最終溶液用水定容至2 mL，按照說明書進行酶聯免疫分析。

1.4 細胞培養

睪丸間質細胞R2C細胞培養在含15%馬血清、3%FBS的F12培養液中，3T3細胞以含10%體積分數FBS的DMEM為培養基，培養環境均為37℃、5%CO2培養箱內，2～3 d換液或傳代一次。

D3細胞采用ES細胞基礎培養基，與飼養層細胞進行共培養，培養環境為37℃、體積分數5%CO2培養箱內。ES細胞基礎培養基的組成成分為DMEM培養基中加入質量分數0.1%β-巰基乙醇，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酰胺，1%丙酮酸鈉，103 U/mL LIF，15%KSR。飼養層獲得方法為以懷孕13.5 d的C57小鼠提取表皮成纖維細胞，在1至5代內可作為飼養層支持ES細胞生長并維持未分化狀態。以含10 μg/mL絲裂霉素C的培養基（含質量分數10%FBS的DMEM）培養MEF細胞2.5 h后，以5×105個/mL的細胞密度將MEF鋪在明膠包被過2.5 h的6孔板中，每孔1 mL，第二天即可作為飼養層接種ES細胞。ES細胞培養至對數期后，消化，離心，重懸于培養皿中，2.5 h后C57小鼠表皮成纖維細胞貼壁，而ES懸浮在培養基中，可被分離出來。

1.5 MTT法測定細胞存活率

細胞培養至對數期，調整細胞濃度，96孔板內每孔接種200 μL細胞懸液。培養24 h后，以含不同濃度CML的含血清培養基繼續培養R2C細胞24 h，3T3 細胞 10 天，或 D3 細胞 10 d（第 1，3，5 天跟換新鮮培養基）后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，置于37℃養箱內4 h。棄去上清，每孔加200 μL二甲基亞砜溶解沉淀，置于水平搖床緩慢振搖10 min后以酶標儀檢測490 nm波長處的吸光值。每組3個復孔，實驗重復3次。

1.6 放射性免疫法測定孕酮分泌量

對數期R2C細胞懸液以1×106個/mL的密度接種到6孔板，每孔1 mL細胞懸液。培養24 h后，換上分別不同濃度的CML培養液，繼續培養24 h后提取上清液，400g離心5 min，-20℃保存。以放射免疫試劑盒處理細胞上清，通過γ計數儀對放射性計數，數據聯機處理后得出各樣品的孕酮含量。

1.7 統計學分析

以上所有檢測所得結果都是用均數±標準差進行表示，并用Graphpad Prism5軟件對數據進行統計分析，*p＜0.05、**p＜0.01 及 ***p＜0.001 表示結果有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 方便面中CML的質量分數

酶聯免疫方法是基于抗原抗體的特異性結合來檢測待測物，CML作為抗原被加入CML抗體包被的試劑盒，再加入酶標抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經充分洗滌后加入顯色劑，最終通過顏色吸光度表征底物濃度。采用沒酶聯免疫法分析20個品牌中方便面中游離態和結合態CML質量分數，并據此 結合態CML質量分數，結果如表1所示。游離態CML質量分數為0.39～0.80 mg/kg，結合態CML質量分數為19.42～34.99 mg/kg。雖然不同品牌方便面之間CML質量分數有所不同，但差距不大。

表1 不同品牌的方便面中CML的質量分數Table 1 Nε-（carboxymethyl） lysine （CML） concentrations in instant noodles of 18 brands

2.2 CML對R2C細胞活性和孕酮水平的影響

CML作用于R2C細胞24 h后，以放射性免疫測定孕酮試劑盒分析培養液中孕酮水平，以MTT法分析細胞活性，結果如圖1所示。CML在1 mmol/L濃度以下對R2C細胞的存活率沒有顯著的抑制作用（p＞0.05），在2 mmol/L濃度時才會導致細胞活性顯著降低（p＜0.01）（圖 1（a）），CML 濃度從 0.25 到 2 mmol/L，對R2C細胞孕酮水平均沒有顯著性影響（圖 1（b））。

2.3 CML對3T3和ES細胞活性的影響

CML作用于3T3細胞和D3細胞10 d后的細胞活性如圖2所示，CML作用濃度達到4 mmol/L時3T3細胞存活率仍沒有顯著降低，說明該濃度下的CML對3T3細胞沒有細胞毒性作用。CML作用濃度達到1 mmol/L時ES細胞存活率顯著降低，說明1 mmol/L濃度下的CML對ES細胞有細胞毒性，而1 mmol/L得CML對3T3細胞活性沒有顯著影響，說明D3細胞比3T3細胞更加敏感。

圖1 CML對R2C細胞活性和孕酮分泌量的影響Fig.1 Effect of CML on cell viability and progesterone secretion of R2C cells

圖2 CML對3T3和D3細胞活性的影響Fig.2 Effect of CML on viability of 3T3（A） and D3 cells

3 討論

CML是AGEs類物質的代表性研究對象，在糖尿病及其并發癥，以及衰老的發生和發展過程中起重要作用，其潛在的危害性也越來越受到人們的關注。CML可在體內生成，也可通過外部攝入，其中外部攝入大部分是通過膳食攝入。在食品的加工和加熱過程中易產生CML，故作者選取日常食用的方便面為研究對象，通過酶聯免疫法分析其中CML含量，并通過R2C和ES細胞的體外培養試驗初步研究CML的雄性生殖和胚胎發育毒性。

作者通過對市場中20中不同品牌的方便面的分析，結果表明，游離態CML質量分數為0.39～0.80 mg/kg，結合態CML質量分數為19.42～34.99 mg/kg。周燕瓊[14]以UPLC-MS技術測定了方便面中結合態和游離態CML的總質量分數，結果為20.26 mg/kg。作者使用體積分數70%甲醇溶液萃取樣品后以ELISA分析CML含量，和卞華偉等以Cleanert C18固相萃取柱萃取樣品后以HPLC-MS分析，可能由于前處理和檢測的方法不同，導致結果有較大的差異。一包油炸方便面面餅的質量在70～100 g之間。人體體重設為標準體重60 kg，若每人每天攝食一包方便面，依據結合態CML在19.42～34.99 mg/kg之間，則每天通過食用方便面攝入的結合態CML約為 22.66～58.32 μg/kg，即 0.11～0.28 μmol/L，游離態 CML 約為0.46～1.33 μg/kg，即 0.002 2～0.006 4 μmol/L。

飲食攝入的CML一部分會進入體內循環，一部分會在肝，肌肉或腎等器官中蓄積，也有部分CML或其代謝物從尿液中排出。食源性CML被吸收后主要在腎蓄積，也由腎清除。一項對11～14歲健康人群的試食試驗表明，CML的吸收排泄和飲食攝入的CML的濃度有關[15]，具體表現為美拉德反應產物含量低的膳食與美拉德反應產物含量高的膳食相比，后者會導致更高的CML吸收量，而兩者的尿液CML排出率沒有顯著性差異。食源性CML被消化吸收后會被機體分解一部分，但在機體內的具體代謝過程目前尚不清楚，由于CML對健康具有長期的影響，且食源性CML會和機體內源性CML協同作用危害健康，所以過多的攝入CML是一個值得關注的問題。然而目前尚無文獻報道食源性CML在生殖細胞和胚胎細胞中的濃度，需要進一步的研究探索。

睪酮濃度的降低會導致附睪尾部的精子濃度降低和精子活力降低，引起雄性生殖毒性[16]。雄性生殖系統的正常分化、發育和生理功能的維持依賴于一定水平的睪酮分泌。外源物質對雄性生殖系統的毒性最容易表現為影響睪丸的睪酮生成能力[17]。孕酮是睪酮合成通路中最重要的中間產物之一，其含量可作為評價細胞生殖功能的指標。R2C細胞是大鼠睪丸間質瘤細胞系，能夠在沒有激素刺激的情況下持續大量的分泌孕酮，其他各項生理功能和指標都和睪丸間質細胞一致，故可以代替原代睪丸間質細胞成為體外毒性實驗的細胞模型[18]。CML在1 mmol/L濃度以下對R2C細胞的存活率和孕酮合成均沒有顯著的抑制作用。細胞實驗所用CML為標準品，屬于游離態CML，而作者和其他文獻中方便面CML的含量都很低，故常規食用方便面所攝入的CML不會引起R2C細胞的活性和孕酮分泌量的變化。

作者采用具有多能型的胚胎干細胞D3，以及已分化的成纖維細胞Balb/c 3T3細胞，測試受試物對D3和3T3細胞活性的抑制作用，評價受試物的發育毒性。胚胎干細胞D3是一種多能性的未分化的細胞，而成纖維細胞3T3是一種已分化的不具備多能性的細胞，常被用來和胚胎干細胞做對比，分析受試物的毒性強弱對于全能性細胞和單能性細胞是否有區別。CML濃度4 mmol/L時3T3細胞存活率仍沒有顯著降低，說明該濃度下的CML對3T3細胞沒有細胞毒性作用。CML給藥濃度達到1 mmol/L時ES細胞存活率顯著降低，CML濃度0.5～4 mmol/L時3T3細胞存活率仍沒有顯著降低，說明未分化的ES細胞比已分化的細胞對CML更加敏感。CML在0.5 mmol/L濃度以下對ES細胞的存活率沒有顯著的抑制作用，故常規食用方便面所攝入的CML不會引起ES細胞的活性的變化。

4 結 語

CML的含量，游離態CML含量為0.39～0.80 mg/kg，結合態CML含量為19.42～34.99 mg/kg。根據該數據評估常規食用方便面時CML的攝入量，不會對R2C細胞存活率或孕酮分泌量造成顯著抑制作用，也不會對D3和3T3細胞的存活率造成顯著抑制作用，可認為常規食用方便面所攝入的CML不會引起雄性生殖和胚胎發育毒性。

采用酶聯免疫法測定市售20種品牌方便面中