過(guò)量錳處理對(duì)苗期柱花草生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響

劉攀道，羅佳佳,2，白昌軍，陳志堅(jiān)*，劉國(guó)道*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 儋州571737；2.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?70228)

錳是植物生長(zhǎng)所必需的微量元素之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和生命活動(dòng)的代謝過(guò)程中起重要作用[1]。錳參與光合作用中電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原和光系統(tǒng)II中水的光解過(guò)程[1]。錳還可參與ATP合成、脂肪酸和蛋白質(zhì)的代謝過(guò)程[2]。在我國(guó)可耕作土壤中，錳平均含量可達(dá)573 mg·kg-1，并且，我國(guó)土壤錳含量表現(xiàn)出南方酸性土壤錳含量高于北方的石灰性土壤[3-4]。在酸性土壤中，由于低氧化還原電勢(shì)和低pH，錳以可溶性的形態(tài)進(jìn)入土壤溶液，導(dǎo)致錳含量顯著增加，過(guò)量積累的錳離子會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成毒害，抑制植物生長(zhǎng)[5-6]。

錳毒害癥狀主要表現(xiàn)在葉片上，如出現(xiàn)褐色錳氧化斑、壞死斑和葉片失綠等[1]。錳毒害抑制葉片光合作用，破壞多種重要代謝酶的活性，產(chǎn)生活性氧自由基造成氧化脅迫，影響根系對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、運(yùn)輸和分配，破壞根系組織結(jié)構(gòu)[1,7]。植物的耐錳機(jī)制主要包括把過(guò)量的錳積累在液泡和細(xì)胞壁等非活性部位、增強(qiáng)錳毒害下抗氧化能力、增加根系分泌物螯合根際錳離子減少根系對(duì)錳的吸收[6,8]。不同植物品種或植物的不同基因型的耐錳能力不一樣。

柱花草(Stylosanthesspp.)是主要的熱帶豆科牧草，起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可作為飼料喂養(yǎng)牲畜、作為綠肥覆蓋果園以及培肥和改良土壤等，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益。一般認(rèn)為，起源于酸性土壤的熱帶植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)酸性土壤生長(zhǎng)的能力，其可能具有獨(dú)特的耐酸鋁和酸錳脅迫的機(jī)制[9]，因此，柱花草是研究酸性土壤錳毒害脅迫機(jī)制的良好材料。研究表明，葉片失綠和皺縮是柱花草錳毒害的主要癥狀[5]。并且，增加柱花草根系蘋(píng)果酸的合成與分泌，可以減少根系對(duì)錳的吸收，進(jìn)而緩解錳毒害[10]。目前，已有針對(duì)錳毒脅迫影響柱花草生長(zhǎng)、元素平衡等方面的研究，但是，柱花草響應(yīng)錳毒害是一個(gè)復(fù)雜生理過(guò)程，對(duì)不同基因型及不同生長(zhǎng)期柱花草響應(yīng)錳毒害的研究較少，柱花草是否可以通過(guò)維持根系生長(zhǎng)及提高抗氧化脅迫的能力緩解錳毒害仍不清楚。因此，本研究以2份柱花草基因型為材料，分析不同錳濃度處理對(duì)苗期柱花草根系生長(zhǎng)和抗氧化酶活性等的影響，以期為探索柱花草耐錳機(jī)理及耐錳柱花草品種改良提供理論依據(jù)及種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的2份圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)基因型分別為T(mén)F210和TF226。柱花草種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)處理 參照陳志堅(jiān)等[5]方法，柱花草種子去除外種皮后，80 ℃加熱2 min，冷卻后于黑暗條件下催芽2～3 d，然后，柱花草幼苗移栽至14 L塑料盆中于溫室進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。試驗(yàn)于2017年4月進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為28 ℃/25 ℃(晝/夜)，濕度75%，光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1。營(yíng)養(yǎng)液為1/2 Hoagland溶液，每7 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，每2 d用KOH或H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.8。參照Chen等[10]方法，幼苗生長(zhǎng)1個(gè)月后，移栽至含有不同錳濃度的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中處理7 d。錳濃度分別為5 μmol·L-1(對(duì)照)和400 μmol·L-1MnSO4(過(guò)量錳處理)，營(yíng)養(yǎng)液pH為5.0，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每2 d用KOH或H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.0。處理7 d后，對(duì)柱花草活體葉片進(jìn)行葉綠素和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)測(cè)定。對(duì)一部分植株分別收取地上部和根部樣品，根系用去離子水沖洗干凈，用于根系參數(shù)分析后，地上部和根部樣品在75 ℃下烘干至恒重，稱(chēng)取干重；另一部分植株葉片樣品用液氮速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于酶活性分析。

1.2.2測(cè)定方法 根系用EPSON 1640XL掃描儀(EPSON，日本)進(jìn)行掃描，總根長(zhǎng)和根體積用WinRhizo軟件(Regent Instruments，加拿大)進(jìn)行分析。采用SPAD502型葉綠素分析儀測(cè)定葉綠素含量，用便攜式熒光儀Pocket PEA(Hansatech，英國(guó))測(cè)定葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。柱花草葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)買(mǎi)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。以上每個(gè)指標(biāo)測(cè)定設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2003作圖，用SPSS 20.0(SPSS Institute，美國(guó))軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同錳濃度處理對(duì)柱花草生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，相對(duì)對(duì)照(5 μmol·L-1)處理，過(guò)量錳(400 μmol·L-1)處理均顯著抑制了柱花草基因型TF210的地上部(F=9.2，P<0.05)和根部(F=9.2，P<0.05)干重。在過(guò)量錳處理下，TF210地上部和根部干重相對(duì)對(duì)照分別降低了27.1%和17.6%，差異顯著(P<0.05)(圖1)。但是，過(guò)量錳處理對(duì)基因型TF226地上部和根部干重影響不明顯(圖1)。

圖1 不同錳處理對(duì)柱花草地上部和根部干重的影響Fig.1 Shoots and roots dry weight of stylo at different Mn treatments 不同小寫(xiě)字母表示同一柱花草種質(zhì)在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Different letters indicated significant difference among different treatments at P<0.05 level in the same stylo accession, the same below.

2.2 不同錳濃度處理對(duì)柱花草根系生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，過(guò)量錳(400 μmol·L-1)處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的主根長(zhǎng)(F=5.9，P<0.05)和總根長(zhǎng)(F=10.5，0.010.05)。在過(guò)量錳處理下，TF210主根長(zhǎng)和總根長(zhǎng)相對(duì)對(duì)照分別降低了14.0%和31.5%(圖2)。但是，過(guò)量錳處理對(duì)基因型TF226主根長(zhǎng)、總根長(zhǎng)和根體積均無(wú)顯著影響(圖2)。因此，在過(guò)量錳處理下，基因型TF226能夠維持根系生長(zhǎng)。

2.3 不同錳濃度處理對(duì)柱花草葉綠素濃度(SPDA)及最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

過(guò)量錳(400 μmol·L-1)處理顯著降低了柱花草葉綠素濃度(SPDA)(F=36.4，P<0.001)(圖3)。在過(guò)量錳處理下，TF210和TF226的SPDA值相對(duì)對(duì)照分別降低了35.8%和20.0%，并且，在過(guò)量錳處理下，基因型TF226的 SPDA值顯著高于TF210(P<0.05)(圖3)。

過(guò)量錳處理顯著影響柱花草最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)(F=66.8，P<0.001)，并且，錳處理對(duì)Fv/Fm的影響具有基因型差異(F=7.3，P<0.05)，錳處理和基因型兩因素對(duì)Fv/Fm的交互影響顯著(F=7.8，P<0.05)(圖3)。在過(guò)量錳處理下，TF210和TF226的Fv/Fm值相對(duì)對(duì)照分別降低了30.1%和14.8%，并且，在過(guò)量錳處理下，基因型TF226的Fv/Fm值顯著高于TF210，TF226的Fv/Fm值是TF210的1.2倍(圖3)。因此，TF226是耐錳基因型，而TF210是錳敏感基因型。

圖2 不同錳處理對(duì)柱花草根系生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different Mn levels on root growth of two stylo genotypes

圖3 不同錳處理對(duì)柱花草葉綠素濃度及Fv/Fm的影響Fig.3 Chlorophyll concentration and Fv/Fm in the leaves of two stylo genotypes at different Mn treatments

2.4 不同錳濃度處理對(duì)柱花草組織錳含量的影響

過(guò)量錳處理顯著增加了柱花草地上部組織錳含量(F=225.9，P<0.001)(圖4)。在過(guò)量錳處理下，TF210和TF226地上部錳含量相對(duì)對(duì)照分別增加了15.7和15.3倍(圖4)。類(lèi)似的，過(guò)量錳處理顯著增加了柱花草根部組織錳含量(F=1963.7，P<0.001)，并且，錳處理對(duì)根部組織錳含量的影響具有基因型差異(F=76，P<0.001)，錳處理和基因型兩因素對(duì)根部組織錳含量的交互作用顯著(F=40.3，P<0.001)(圖4)。在過(guò)量錳處理下，雖然TF210和TF226根部錳含量相對(duì)對(duì)照分別增加了8.7和10.9倍，但是，基因型TF210的根部錳含量顯著高于TF226，TF210根部錳含量是TF226的 1.4倍(圖4)。此外，在過(guò)量錳處理下，TF210和TF226根部錳含量分別是地上部錳含量的1.7和1.5倍(圖4)。

圖4 不同錳處理對(duì)柱花草地上部和根部錳含量的影響Fig.4 Mn content in shoots and roots of stylo at different Mn treatments

2.5 不同錳濃度處理對(duì)柱花草抗氧化酶活性的影響

從圖5可以看出，不同錳濃度處理影響柱花草葉片抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性，并且，錳處理對(duì)抗氧化酶活性的影響具有基因型差異。過(guò)量錳(400 μmol·L-1)處理顯著增加了柱花草SOD活性(F=129.7，P<0.001)。相對(duì)對(duì)照(5 μmol·L-1)處理，TF210和TF226在過(guò)量錳處理下的SOD活性分別增加了63.3%和80.5%(圖5)，并且，在過(guò)量錳處理下，TF226的SOD活性顯著高于TF210(F=11.1，P<0.05)。

錳處理和基因型兩因素對(duì)POD(F=10.6，P<0.05)和CAT(F=7.7，P<0.05)活性的交互影響顯著(圖5)。過(guò)量錳處理顯著增加了耐錳基因型TF226的POD和CAT活性(P<0.05)，但對(duì)TF210的POD和CAT活性影響不明顯。在過(guò)量錳處理下，TF226的POD和CAT活性相對(duì)對(duì)照分別增加了44.0%和58.6%(圖5)。并且，在過(guò)量錳處理下，TF226的POD和CAT活性分別是TF210的1.5和1.3倍(圖5)。

圖5 不同錳處理對(duì)柱花草葉片SOD，POD和CAT活性的影響Fig.5 SOD, POD and CAT activities in the leaves of two stylo genotypes at different Mn treatments

3 討論

錳毒害是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素之一。起源于酸性土壤的植物能夠形成獨(dú)特的耐酸錳酸鋁脅迫的機(jī)制，從而表現(xiàn)出超強(qiáng)的適應(yīng)酸性土壤的能力[9]。通過(guò)比較分析12種不同豆科植物的耐錳能力，包括大豆(Glycinemax)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、苜蓿(Medicagosativa)和柱花草等，發(fā)現(xiàn)在這些豆科植物中，柱花草具有較強(qiáng)的耐錳能力[11]。在豇豆(Vignaunguiculata)、大麥(Hordeumvulgare)和大豆中，50 μmol·L-1錳濃度處理會(huì)導(dǎo)致葉片形成褐色錳斑點(diǎn)的錳毒害癥狀，并抑制了植物的生長(zhǎng)[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，柱花草在低于200 μmol·L-1的錳濃度處理下并沒(méi)有出現(xiàn)錳毒害的癥狀，只有在400 μmol·L-1的錳濃度處理下才顯著降低了柱花草錳敏感基因型TPCR2001-1葉片的葉綠素濃度和植株干重，說(shuō)明柱花草錳毒害表現(xiàn)出基因型差異[10]。因此，本研究以2份柱花草基因型(TF210和TF226)為材料，分析過(guò)量錳(400 μmol·L-1)處理對(duì)苗期柱花草生長(zhǎng)的影響及其可能的耐錳機(jī)制。

在水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)和大麥等植物中，錳毒害所產(chǎn)生的氧化脅迫破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)、影響光合作用的電子傳遞過(guò)程，進(jìn)而抑制植物的生長(zhǎng)，而耐錳的植物或基因型則表現(xiàn)出能夠維持較強(qiáng)的光合作用和植株生長(zhǎng)能力[14-16]。在本研究中，過(guò)量錳處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的地上部和根部干重以及根系生長(zhǎng)，降低了TF210葉片SPAD和Fv/Fm值，但對(duì)基因型TF226生長(zhǎng)影響不明顯(圖1～3)，說(shuō)明TF226為耐錳基因型，而TF210為錳敏感基因型。值得注意的是，過(guò)量錳處理顯著抑制了柱花草基因型TF210的主根長(zhǎng)和總根長(zhǎng)，但對(duì)TF226根系生長(zhǎng)影響不明顯(圖2)。類(lèi)似的，過(guò)量錳處理會(huì)顯著抑制大豆、水稻和小麥根系的生長(zhǎng)[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)量錳處理下，小麥根系可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他礦質(zhì)元素(如鎂、鈣、鐵和磷等)的吸收和分布，從而影響小麥的耐錳能力[16]。因此，在過(guò)量錳處理下，通過(guò)維持根系的正常生長(zhǎng)，可能有助于TF226根系對(duì)其他養(yǎng)分的吸收和運(yùn)輸，從而緩解TF226錳毒害。

在本研究中，盡管過(guò)量錳處理顯著增加了柱花草組織錳含量，但耐錳基因型TF226地上部和根部的錳含量顯著低于TF210(圖4)，這與Chen等[10]研究結(jié)果相似，說(shuō)明降低組織錳的積累可能是TF226耐錳的機(jī)制之一。另一方面，在過(guò)量錳處理下，雖然TF226地上部和根部錳含量顯著低于TF210，且未表現(xiàn)出錳抑制生長(zhǎng)的明顯癥狀，但是過(guò)量錳處理仍然顯著增加了TF226地上部和根部的錳含量(圖4)。研究發(fā)現(xiàn)，在一些植物中，細(xì)胞中累積的錳，可能被有機(jī)酸等螯合并儲(chǔ)存在液泡中[18-20]。例如，在豇豆中，植株內(nèi)部80%的錳離子可以被檸檬酸所螯合[21]。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量錳處理顯著增加了柱花草耐錳基因型Fine-stem葉片和根部的內(nèi)源蘋(píng)果酸濃度，增加合成的蘋(píng)果酸可能進(jìn)一步形成錳-蘋(píng)果酸復(fù)合物，從而緩解了錳毒害[10]。因此，柱花草基因型TF226組織中的錳離子可能被某些物質(zhì)螯合(如有機(jī)酸)，并隔離在液泡中，從而未表現(xiàn)出錳毒害的癥狀。

在柱花草中，組織中錳離子的過(guò)量積累，會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)造成氧化脅迫，破壞細(xì)胞內(nèi)多種重要代謝酶的活性，從而抑制葉片光合作用，進(jìn)而影響了柱花草植株和根系的生長(zhǎng)。為了適應(yīng)錳毒害，植物可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力(抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量)提高抵抗錳毒害的能力[13,15,22]。研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)量錳誘導(dǎo)的氧化脅迫下，水稻幼苗可以通過(guò)增強(qiáng)SOD，CAT和APX(抗壞血酸過(guò)氧化物酶)等酶活性，清除組織內(nèi)積累的活性氧自由基，從而緩解錳毒害[15]。并且，在錳毒害下，增強(qiáng)POD活性及其蛋白表達(dá)，被認(rèn)為是豇豆響應(yīng)錳毒害的重要機(jī)制[22]。在本研究中，過(guò)量錳處理顯著增加了耐錳基因型TF226葉片SOD，POD和CAT活性(圖5)，這些抗氧化酶活性的增加，可能在降低由錳毒害造成的氧化脅迫中起重要作用，從而增強(qiáng)了TF226耐錳能力。

4 結(jié)論

綜上所述，在柱花草中，錳毒害下過(guò)量積累錳離子，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，破壞葉綠素合成及光合作用，進(jìn)而抑制柱花草植株生長(zhǎng)。相對(duì)柱花草基因型TF210，TF226具有較強(qiáng)的耐錳能力，是耐錳基因型。在錳毒害下，基因型TF226可能通過(guò)減少錳的積累并提高抗氧化酶活性，降低由錳毒害造成的氧化脅迫傷害，從而保持較高的葉綠素濃度和最大光化學(xué)效率，進(jìn)而維持了地上部和根系的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果為探索柱花草耐錳機(jī)理及耐錳柱花草品種改良提供了理論依據(jù)及種質(zhì)材料。