乙烯對匍匐翦股穎ISR抗病反應中AsA-GSH 循環及胼胝質沉積的影響

姜寒玉,王亞峰,徐明,甘培文，張金林，馬暉玲

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中—美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)為禾本科翦股穎屬(Agrostis)多年生草本植物，屬冷季型草坪草，因其具有適應性強，抗寒耐旱，草質柔軟細嫩，生長迅速，觀賞性強等優良特性，是高爾夫球場球道，草地網球場等理想的高品質草坪草，也是庭院、公園等養護水平較高的綠地首選草種。匍匐翦股穎不定根入土淺，喜水，抗病害能力差，易感染幣斑病、褐斑病、霜霉病和黑粉病等，從而引起草坪品質、功能等方面的嚴重退化，給草坪生產管理和經營帶來巨大損失[1]。

在病原物的作用下，植物產生的自我免疫基于一套高度靈活且復雜的響應機制，植物首先利用最初產生的生理生化屏障，其次激活某些可誘導的防御機制，最終提高系統性響應免于病原物的進一步侵染。目前,人們已了解幾種生物誘導的系統性防御響應機制，其一為系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)，它通常由病原物侵染誘導產生，防止進一步感染[2]，另一種為誘導系統抗性(induced systemic resistance，ISR)，它往往由土壤根際的植物促生菌(PGPR)激活[3-4]?，F已在豆類、馬鈴薯(Solanumtuberosum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等植物中都發現ISR反應，其對細菌、真菌和病毒具有廣譜抗性[5]。丁二醇(butanediol, BDO)是一種新型的抗病性誘導因子，具有無毒、無污染和抗病性持久的優點。2010年加拿大學者Cortes-Barco等[6]對匍匐翦股穎的抗病性誘導作用進行了首次報道，其能夠誘導ISR抗病方式并有效抑制草坪葉病。隨后，研究發現BDO可誘導匍匐翦股穎產生抗病性，其抗病效果優于通過SAR途徑由苯并噻二唑(BTH)引致的抗病性[7]。

乙烯是ISR誘導系統中重要的信號分子，為了進一步探清其在ISR信號途徑中的作用，有研究以乙烯信號突變型植株為試驗對象，發現通過根部施入熒光假單胞桿菌(Pseudcmonasfluoroscercs)WCS417r不能誘導植株對丁香假單胞菌番茄(Solanumlycopersicum)致病變種(Pst DC3000)的抗病性，無ISR系統響應機制[8]，從而證實了乙烯信號通路與ISR機制的建立密切關聯。在對擬南芥植株ISR系統的研究中發現，茉莉酸-乙烯(JA/ET)響應型基因包括Lox1、Lox2、VSP2、PDF1.2、HEL、CHI-B和PAL1等，這些基因均可被JA/ET信號激活得以表達，表達產物能夠對多種病原物產生抗性[9]。通過研究與乙烯抗病信號轉導途徑有關的ETR1、EIN2基因對植物防御素PDF1.2基因表達的影響發現，乙烯與PDF1.2的合成有關，外施乙烯能夠提高PDF1.2基因的轉錄和翻譯水平，而SA不能誘導PDF1.2基因的表達[10-11]。

當病原物侵染植物時，細胞內開始積累大量的活性氧(reactive oxy gen species, ROS)，而ROS清除系統通過具有氧化還原性的酶和抗氧化物質協同作用。抗壞血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione，AsA-GSH)循環在該系統中發揮關鍵作用，清除過程中引起了AsA、GSH及相關酶活性的變化，誘導了植物的抗病性防御反應[12]。因此抗壞血酸過氧化物酶(peroxidase, APX)、AsA和GSH是AsA-GSH循環的重要組分。如真菌灰葡萄菌侵染番茄葉片后，改變了植株AsA-GSH循環，APX、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)等酶活性降低，GSH和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性增強，導致脫氫抗壞血酸(DHA)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量積累，AsA/GSH降低，抗壞血酸和谷胱甘肽含量減少[13]。同時AsA和GSH可作為信號分子直接調控MAP激酶，從而調節水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的合成，最終介導植株對病原物的防御反應[14-15]。

胼胝質，即β-1,3葡聚糖，當植物受到病原物侵害后能夠迅速在質膜和細胞壁之間沉積，并誘導產生特定的防御機制[16]。研究發現，大豆(Glycinemax)在抵御花葉病毒侵染過程中，產生了大量的胼胝質從而限制了病毒的胞間運輸[17]。抗病性越強的品種在侵染點越早地積累了胼胝質，其沉積特點與大豆抗病毒侵染密切相關[18]。在mapk4突變型擬南芥植株中，AtGsl5基因與擬南芥抗病性密切相關，該基因在mapk4中高效表達，胼胝質合成酶活性升高，同時胼胝質大量累積，進一步證實了胼胝質在植物抗病性中的重要作用[19-20]。

為了探討乙烯對匍匐翦股穎ISR抗病反應中AsA-GSH循環以及胼胝質沉積的影響，本研究以立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染匍匐翦股穎，通過BDO誘導產生ISR抗病反應后，采用不同濃度的乙烯誘導劑和抑制劑噴施葉片，探討在ISR抗病反應中AsA、GSH含量及相關酶活性以及胼胝質的沉積部位、大小和數量等變化，從而揭示乙烯信號分子在匍匐翦股穎ISR抗病生理響應中的作用特點，以期為匍匐翦股穎抗病性研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試品種及病原菌

供試匍匐翦股穎選取北方常見品種Penn-A4，由北京克勞沃公司提供。立枯絲核菌菌種(#3.2888) 購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 材料種植及處理

試驗于2016年7月進行，在規格為10 cm×10 cm×8 cm的方形花盆中裝入滅菌的沙土混合物(土∶沙=2∶1)。種子用無菌水浸泡6 h，70%乙醇沖洗1 min，次氯酸鈉浸泡15 min，后用無菌水沖洗6次。每盆均勻撒播處理后的匍匐翦股穎種子0.3 g，覆蓋一薄層沙土，每日定量澆水15 mL。置于(25±2) ℃恒溫條件下生長，光周期為16 h·d-1。

立枯絲核菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)中，25 ℃培養4 d后用打孔器取6 mm直徑菌絲塊，加入到PDA培養基中，在25 ℃ 100 r·min-1的條件下培養4 d，取出菌團，去掉中心的培養基顆粒，然后將菌絲放入無菌水中清洗，清洗完成后，擰干菌絲放入研缽進行研磨，研磨成勻漿后加入無菌水，濃度為OD340 nm=0.8。

待匍匐翦股穎長至10 cm左右時，將15 mL 100 μmol·L-1BDO直接澆灌到幼苗根部土壤中，連續澆灌5 d。配制含0.01%吐溫的菌液，采用菌絲懸浮液噴霧法接種匍匐翦股穎，每盆均勻噴灑15 mL的菌液，噴灑完成后等5 d，誘導ISR反應。取生長情況相同的盆栽苗，采用乙烯抑制劑氯化鈷(CoCl2)和促進劑1-氨基環丙烷羧酸(1-amino cyclopropane carboxylic acid, ACC)處理幼苗，處理濃度分別為A：1 mmol·L-1CoCl2；B：3 mmol·L-1CoCl2；C：5 mmol·L-1CoCl2；D：50 μmol·L-1ACC；E：75 μmol·L-1ACC；F：100 μmol·L-1ACC；CK為清水對照。每個處理5個重復。上述處理每次均噴施15 mL，噴施5、10、15 d后取材，參考文獻[21]的方法，進行石蠟切片的制備，同時剪取噴施10 d的葉片進行生理指標的測定。

1.3 抗病生理指標的測定方法

匍匐翦股穎幼苗經BDO誘導產生ISR抗病反應，在ET促進劑ACC或抑制劑CoCl2處理后，測定了AsA-GSH循環中各生理特性的變化。APX活性的測定參照Nakano等[22]的方法，GR活性的測定參照Foyer 等[23]的方法，AsA含量的測定參照Kampfenkel等[24]的方法，GSH和GSSG含量的測定參照Anderson等[25]的方法。

1.4 石蠟切片的制備方法

1.4.1取材 每個處理每盆隨機剪取1株匍匐翦股穎幼苗，然后去掉根部，葉尖，保留中部葉片，切成5 mm左右的小段，混勻保存于裝有福爾馬林-醋酸-酒精固定液(FAA)的青霉素小瓶，置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2脫水、透明 材料經FAA固定12～16 h后，依次放入15%、30%、50%、70%、85%的乙醇中梯度脫水，各濃度脫水20 min，后于95%乙醇中脫水30 min，無水乙醇中脫水2次，各20 min。然后依次置換1/2二甲苯、二甲苯進行透明，于1/2二甲苯中透明1 h，二甲苯中透明2次，每次30 min，直至材料完全透明為止。

1.4.3浸蠟、包埋 在裝有透明材料的青霉素小瓶中加碎蠟2次，第1次加入與瓶中二甲苯等量的碎蠟，放入電熱鼓風干燥箱中，36 ℃保持1 h，待碎蠟完全融化后，加入瓶中液體50%的碎蠟， 36 ℃保存12 h，溫度調至42 ℃，置換50%石蠟保持1 h，溫度調至50 ℃，置換75%的石蠟保持30 min后，溫度調至60 ℃，依次置換純石蠟3次，各30 min，TKY-BMB型石蠟包埋機進行包埋。1個蠟塊中1個材料，蠟塊的尺寸為：0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(每個處理至少包埋蠟塊10個)，將包埋好的蠟塊冷卻后直接修塊，進行切片或保存到4 ℃冰箱備用。

1.4.4切片、展片、烤片 采用輪式手動切片機進行連續切片，厚度10 μm，切片時每個蠟塊中材料的前面部分切除，每個蠟塊切片10張，每張蠟帶至少含有8個材料。將恒溫水浴鍋溫度調節至45 ℃，在500 mL大燒杯加入蒸餾水放入水浴鍋中，將切好的蠟帶光面朝下放入燒杯中，待蠟帶完全展開后，將涂抹好蛋清甘油的載玻片伸入燒杯中，使蠟帶粘到載玻片上，將粘有蠟帶的載玻片自然晾干后，在光學顯微鏡下觀察展片效果，取展片效果好的片子(每個處理鏡檢切片數約30張)置于電熱鼓風干燥箱中于38 ℃下烘烤，使之完全干燥。

1.4.5染色、封片 取干燥后的片子，依次放入加有二甲苯、1/2二甲苯、95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇、磷酸緩沖液、0.1%的苯胺藍染色劑的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5 min，95%的乙醇、85%的乙醇、70%的乙醇、50%的乙醇、30%的乙醇中各5 s，磷酸緩沖液中10 min，0.1%的苯胺藍染色劑中30 min。最后將染色后的片子取出，置于蒸餾水中30 s，洗凈片子上的雜質后，過1/2二甲苯、二甲苯各10 s，待片子干燥后采用中性樹膠封片。

1.4.6拍照觀察 將所得切片自然風干后，置于LeiCa DM6000 B熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 數據分析

使用IBM SPSS Statistics 22和Microsoft Office Excel 2010進行數據分析和統計，胼胝質顆粒大小用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析計算，每個處理鏡檢片數30張，每張取5～10個視野。根據檢測的維管束數量及其上沉積的胼胝質沉積部位、大小、數量，計算出平均每個維管束中胼胝質的沉積數量和沉積面積。

2 結果與分析

2.1 不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中AsA-GSH循環的影響

2.1.1不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中APX活性的影響 如圖1A所示，經不同濃度CoCl2和ACC處理后，匍匐翦股穎幼苗葉片的APX活性均顯著高于CK。隨著CoCl2處理濃度的增加，APX活性呈先降低后升高的趨勢，在處理濃度為5 mmol·L-1條件下升至最高，為595.56 U·g-1。隨著ACC處理濃度的增加，APX活性也呈現先降低后升高的趨勢，在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達755.56 U·g-1。在乙烯促進劑ACC處理下，APX活性顯著高于CoCl2的處理活性(P<0.05)。

2.1.2不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中AsA含量的影響 不同濃度ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理的AsA含量差異顯著(圖1B)。ACC處理下的AsA含量顯著高于對照及CoCl2處理，且隨著處理濃度的增加，AsA含量也顯著升高，并在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達666.16 μmol·g-1。各濃度CoCl2處理下，AsA含量均低于對照，并維持較低水平，且各處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中AsA-GSH循環的影響Fig.1 Effects of the ascorbate-glutathione cycle in ISR reaction of creeping bentgrass with different concentration CoCl2 and ACC treatment 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The different letters mean significant difference at P<0.05. CK: Water control; A: 1 mmol·L-1 CoCl2; B: 3 mmol·L-1 CoCl2; C: 5 mmol·L-1 CoCl2; D: 50 μmol·L-1 ACC; E: 75 μmol·L-1 ACC; F: 100 μmol·L-1 ACC.

2.1.3不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中GR活性的影響 在匍匐翦股穎ISR抗病反應中，不同濃度CoCl2及ACC處理下的GR活性均顯著高于對照(圖1C)。ACC處理下的GR活性顯著高于CoCl2處理條件。隨著CoCl2及ACC處理濃度的升高，GR活性均呈現顯著上升的趨勢，分別在5 mmol·L-1CoCl2和100 μmol·L-1ACC處理下升至11.66和18.13 U·g-1(P<0.05)。

2.1.4不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中GSH含量的影響 不同濃度ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理GSH含量差異顯著(圖1D)。隨著CoCl2處理濃度的升高，GSH含量逐漸降低，在5 mmol·L-1CoCl2處理下降至最低，為153.99 μmol·g-1。隨著ACC處理濃度的升高，GSH含量顯著增加，在100 μmol·L-1ACC處理下升至最高，達203.78 μmol·g-1(P<0.05)。

2.1.5不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中GSSG含量的影響 匍匐翦股穎ISR抗病反應中，ACC處理下的GSSG含量顯著低于CoCl2及對照(圖1E)。經3 mmol·L-1CoCl2處理后，GSSG含量升至最高，為118.47 μmol·g-1，而經75 μmol·L-1ACC處理后，GSSG含量則降至最低，為54.14 μmol·g-1(P<0.05)。

2.1.6不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中GSH/GSSG的影響 如圖1F所示，各處理條件下GSH/GSSG差異顯著。經ACC處理后的GSH/GSSG顯著高于CoCl2及對照。在75 μmol·L-1ACC處理下GSH/GSSG達到最高，為3.64，而在3 mmol·L-1CoCl2處理下GSH/GSSG降至最低，為1.36。此外，ACC處理下的GSH/GSSG顯著高于對照，而CoCl2處理下的GSH/GSSG則顯著低于對照(P<0.05)。

2.2 不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中胼胝質沉積的影響

2.2.1不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中胼胝質的主要沉積部位、大小和數量的影響 由圖2所示，匍匐翦股穎葉片中胼胝質的主要沉積部位是厚壁細胞、韌皮部、木質部及表皮組織(圖2D～F)，其中韌皮部中胼胝質的沉積形態主要為絲狀、小顆粒狀、中顆粒狀和大顆粒狀四種形式(圖2A～C)。此外，在同一維管束中可觀察到不同的胼胝質形態，圖2B顯示胼胝質沉積主要為韌皮部絲狀、大顆粒狀及厚壁細胞絲狀胼胝質，圖2C中沉積的主要為韌皮部絲狀及中小顆粒胼胝質，圖2E中顯示沉積的主要為韌皮部、厚壁細胞絲狀胼胝質，圖2F中沉積類型為木質部、韌皮部和厚壁細胞絲狀胼胝質。圖2G顯示了大量的胼胝質沉積，主要以絲狀胼胝質為主。

圖2 匍匐翦股穎葉片中胼胝質的大小(圖A～C)、分布部位(圖D～F)以及葉片橫切面(圖G)Fig.2 Distribution of callose in creeping bentgrass leaves size (Figure A-C), parts (Figure D-F) and leaf cross section (Figure G) 圖中淡黃綠色亮斑為胼胝質；A:韌皮部絲狀胼胝質；B:韌皮部大顆粒胼胝質；C:韌皮部中顆粒和小顆粒胼胝質；D:表皮組織；E:木質部；F:主維管束；G:葉橫切面。Callose： Yellowish green fluorescence light spot; A: Filamentous callose in parenchyma tissue; B: Great particle of callose in parenchyma tissue; C: Small and middle particle in parenchyma tissue; D: Epidermal tissue; E: Xylem tissue; F: Main vein; G: Leaf cross sections.

表1顯示了不同濃度乙烯抑制劑(CoCl2)及促進劑(ACC)處理下匍匐翦股穎葉片中胼胝質的主要沉積部位、大小和數量。在不同的處理條件和處理時間下，厚壁細胞的胼胝質沉積均高于其他組織部位。在CoCl2和ACC處理5 d后，匍匐翦股穎幼苗葉片的胼胝質沉積出現了不同的變化趨勢，CoCl2處理下表皮組織、厚壁細胞和木質部的胼胝質沉積總量高于韌皮部，而且隨著CoCl2處理濃度的升高，韌皮部中胼胝質的總量呈下降趨勢，反之，隨著ACC處理濃度的升高，韌皮部中胼胝質的數量則逐漸增加，同時CoCl2和ACC處理下的韌皮部胼胝質總量均高于對照。在CoCl2和ACC處理10 d后，匍匐翦股穎幼苗葉片的胼胝質沉積總量表現出相同的變化趨勢，二者處理下表皮組織、厚壁細胞和木質部的胼胝質沉積總量高于韌皮部，隨著CoCl2處理濃度的升高，韌皮部、木質部及表皮組織中的胼胝質沉積總量呈下降趨勢，反之，隨著ACC處理濃度的升高，所有組織部位中胼胝質的數量均呈增加趨勢，同時,CoCl2處理下的木質部、厚壁細胞和表皮組織的胼胝質總量高于對照。CoCl2和ACC處理15 d后的胼胝質沉積與前期處理呈現不同的變化趨勢， 兩種處理條件下表皮組織、厚壁細胞和木質部的胼胝質總量均高于韌皮部，隨著CoCl2處理濃度的升高，所有組織胼胝質的沉積總量均逐漸降低，同時隨著ACC處理濃度的升高，胼胝質的沉積總量也呈現出降低趨勢。由此可知，經BDO誘導ISR反應的匍匐翦股穎感染褐斑病后，乙烯對匍匐翦股穎葉片組織中胼胝質的沉積具有一定程度的影響，主要沉積部位在厚壁細胞、韌皮部組織、木質部組織和表皮組織，其中厚壁細胞和木質部胼胝質沉積較多，而表皮組織胼胝質沉積較少。一定濃度的乙烯抑制劑能夠降低胼胝質的沉積數量，乙烯促進劑則增加了胼胝質的沉積，提高了匍匐翦股穎幼苗的抗病性。同時厚壁細胞的胼胝質沉積數量顯著高于其他部位，可見該位置是匍匐翦股穎抵御病害侵染的主要障礙，防止病害對植株的進一步侵染。

表1 匍匐翦股穎葉片中胼胝質的沉積主要部位以及各部位數量Table 1 The callose main deposition positions and number of different in leaves of creeping bentgrass

注：上表數據均為平均值，胼胝質大顆粒的面積大于0.01 mm2；胼胝質中顆粒的面積小于0.01 mm2大于0.005 mm2；胼胝質小顆粒的面積小于0.005 mm2大于0.001 mm2；絲狀胼胝質為面積小于0.001 mm2的顆粒。

Note: The data are mean value. Area of greater particle callose is more than 0.01 mm2; Area of middle particle callose is less than 0.01 mm2and more than 0.005 mm2; Area of small particle callose is less than 0.005 mm2and more than 0.001 mm2; Area of filamentary form callose is less than 0.001 mm2.

2.2.2不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中胼胝質沉積面積的影響 由表2可得，在CoCl2和ACC噴施處理5 d時，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質的沉積面積在乙烯合成抑制劑CoCl2各處理間無顯著性差異，在50 μmol·L-1ACC處理下則顯著低于其他處理濃度，胼胝質沉積面積較對照少0.05 mm2，胼胝質沉積個數較對照多30.45。在CoCl2和ACC噴施處理10 d時，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質的沉積面積在CoCl2各處理間無顯著性差異，但50和75 μmol·L-1ACC處理下胼胝質的沉積量顯著高于100 μmol·L-1ACC處理條件，亦顯著高于CK。在CoCl2和ACC噴施處理15 d時，匍匐翦股穎幼苗葉片中胼胝質沉積面積在CoCl2和ACC各處理間無顯著差異。由此可見， 50 μmol·L-1ACC處理5 d時胼胝質沉積最少，而50和75 μmol·L-1ACC處理10 d時胼胝質沉積面積明顯高于CoCl2，處理15 d時各處理間無顯著差異。乙烯分子對由BDO誘導的ISR反應中胼胝質的沉積具有一定影響， 但隨著病害脅迫時間的延長，胼胝質沉積面積逐漸減少，且在病菌侵染初期，低濃度乙烯條件(50 和75 μmol·L-1ACC)使得匍匐翦股穎ISR反應中胼胝質的沉積顯著增加，增強了匍匐翦股穎幼苗的抗病性，但至侵染后期，胼胝質逐漸降解，沉積面積減少，各處理間無顯著差異。

表2 匍匐翦股穎葉片中胼胝質的沉積面積Table 2 The callose deposition area in the creeping bentgrass leaves

注：表中數據用新復極差法進行檢驗，同列數據后不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平。

Note：Data in the Table with the new multiple range method tests. Different lowercase letters in the same column were significantly different at 0.05 levels.

3 討論

3.1 不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中AsA-GSH循環的影響

AsA-GSH循環在ROS清除反應中具有重要作用。在該循環中，AsA作為特定的電子供體通過APX減少了H2O2，即在APX的催化下將H2O2還原成H2O，同時AsA被氧化成脫氫抗壞血酸，氧化的脫氫抗壞血酸則由GSH通過非酶促方式還原，從而構成AsA-GSH循環[26]。APX主要存在于細胞質、葉綠體和線粒體等部位，能夠清除植物體內大量累積的H2O2，該酶過量表達能夠減少H2O2對植物的毒害作用。同時抗壞血酸是植物體內非酶活性氧清除系統的重要組成部分[27]。對煙草(Nicotianatabacum)與TMV(煙草花葉病毒)互作體系的深入研究發現，煙草遭受病毒侵染后，其體內活性氧大量產生，APX活性下降，防止了H2O2的有效降解，而H2O2能夠誘導程序性細胞壞死，并激活病程相關蛋白基因的表達，防止病毒的進一步侵染，反之，H2O2水平的過高積累再次誘導了APX活性的增加[28-29]。本研究發現，隨著CoCl2和ACC處理濃度的增加，APX活性均呈現先降低后升高的趨勢，當APX活性降至最低時，匍匐翦股穎幼苗體內H2O2大量積累，抑制病害侵染，增強植株抗病性。但經高濃度CoCl2和ACC處理后APX活性升至最高，降低了H2O2在植株體內水平。Li等[30]的研究結果也表明，病毒侵染的初期階段，APX活性降低，但隨著H2O2大量積累植物細胞破壞，APX活性又有所升高。經一定濃度的ACC和CoCl2處理，匍匐翦股穎植株體內APX活性均顯著高于對照，且經ACC處理后APX活性升至最高?？梢?，一定濃度的乙烯能夠調節匍匐翦股穎在ISR抗病反應中APX的活性，積累H2O2誘導過敏反應，消除H2O2保護植株正常細胞，既確?；钚匝踉谥苯右志罢T導抗性基因等ISR抗病反應中的作用，又防止活性氧過量積累傷害細胞。

AsA能夠作為信號物質誘導抗病基因表達，對植物中ROS，H2O2和ABA、SA、JA和乙烯等植物激素的含量有一定的調控作用，從而對植物的抗病性產生積極作用。在擬南芥vtc1突變體中，AsA的缺乏導致病程相關蛋白PR1、PR2和PR5編碼基因的不同表達[31]。同時，外源AsA可誘導煙草對TMV產生全株抗性，并表達了酸性PRs抗性蛋白基因，增強了煙草對TMV的抗病性[32]。本研究結果表明，不同濃度CoCl2和ACC處理匍匐翦股穎幼苗后，各處理的AsA含量差異顯著，且經ACC處理后的AsA含量顯著高于CoCl2處理?？梢?，匍匐翦股穎ISR抗病反應中ET的積累誘導了AsA含量的升高，增強了植株抗病性。同時隨著乙烯濃度的積累，AsA含量達到最高。房媛媛等[33]研究發現匍匐翦股穎植株經BDO誘導的ISR抗病反應中，隨著接菌時間的延長，AsA和DHA含量也顯著積累，有效誘導了匍匐翦股穎對褐斑病的抗性。

在AsA-GSH循環中，脫氫抗壞血酸再生AsA與GR活性密切相關，GR活性升高，促進DHA還原為AsA，也催化GSSG還原為GSH，GSH直接或間接地調控了活性氧的合成，誘導了防御基因的表達，介導了植物體的防御反應。灰葡萄菌侵染番茄葉片后，AsA和GSH含量顯著降低，GR活性增強[34]。病毒感染細胞后，GSH/GSSG顯著下降，這被認為是病毒感染后氧化逆境的產生[35]。本研究中，低濃度的乙烯環境下，匍匐翦股穎幼苗中AsA含量較低，APX活性下降，大量還原型谷胱甘肽GSH被催化還原為GSSG，GSSG大量積累，同時GR活性較低，GSSG經GR少量還原為GSH，GSH保持較低水平。而高濃度的乙烯環境下，AsA含量較高，APX活性升高，GSSG在高活性GR作用下催化還原為GSH，使得GSH大量積累。研究發現，GSH能夠調控JA/ET信號轉導途徑中相關基因的表達，而JA和ET是ISR抗病反應中重要的信號分子[36]。因此，在匍匐翦股穎ISR抗病反應中，一定濃度乙烯能夠誘導AsA和GSH含量的積累，它們不僅參與了活性氧的代謝平衡，同時也作為信號分子在ISR抗病反應中起到重要作用。

3.2 不同濃度CoCl2及ACC處理對匍匐翦股穎ISR反應中胼胝質沉積的影響

大量研究表明，病原菌侵染植物時，胼胝質的沉積是一種常見的細胞應答反應，經常以胼胝質的積累作為抗病性強弱的指標。白粉菌感染擬南芥(Arabidopsisthaliana)、細菌感染豌豆(Pisumsativum)時，被感染的細胞壁處加厚，產生大量的胼胝質沉積，感染TMV的煙草，植株整個葉片細胞壁上都有胼胝質沉積，且抗病植株沉積量顯著高于感病植株[37]。此外，泡桐(Paulownia)感染叢枝病(MLO)后，抗病性和感病無性系篩管胼胝質的沉積存在顯著差異，在抗病系中胼胝質大量沉積[38]。本研究中匍匐翦股穎葉片感染褐斑病后有大量的胼胝質沉積，且沉積部分主要是維管束鞘厚壁細胞、韌皮部、木質部及表皮組織。丁新倫等[39]實驗表明，在水稻條紋病(RSV)的脅迫下，感病水稻葉片組織中胼胝質的熒光強度與健株無顯著差異，但是抗病水稻葉片組織中胼胝質的熒光強度卻較健株明顯增強，且大維管束鞘內層厚壁細胞、木質部和韌皮部以及大維管束鞘延伸的厚壁組織、小維管束、表皮細胞以及葉肉細胞均有胼胝質熒光出現。

植物抗病信號傳導途徑分為兩條，分別是SA和JA/ET信號途徑，其中 JA/ET信號途徑介導ISR，在JA和ET的相互作用下，影響了植物次生代謝物質的積累[33]。研究發現，芒果(Mangiferaindica)采后使用10 μmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)處理顯著降低了貯藏期的病情指數和接種炭疽病菌的病斑直徑，使用10 μmol·L-1的MeJA處理顯著促進了貯存期接種炭疽桿菌芒果果實內源激素乙烯的釋放，其釋放速率呈現出前期迅速增高后期急劇下降的趨勢，有效增加了貯藏期芒果的抗病性[40]。蘇晶等[41]試驗發現，使用1.0 μL·L-11-MCP處理可以抑制傷口應激早期乙烯的釋放，傷口組織中苯丙氨酸酶(PAL)和過氧化物酶(POD)活性受到抑制，降低了傷口處總酚和木質素的含量，延緩了愈傷的進程，增加了果實對灰霉菌的易感性，且1.0 μg·L-1的1-MCP處理可以提高果實乙烯的釋放量，加快愈傷進程，提高果實的抗病性。上述研究表明，一定濃度的乙烯處理與植物的抗病性呈顯著正相關，且抗病性越強，染病后胼胝質的沉積越多，但目前尚未有ET在草坪草ISR抗病性響應中的作用的相關報道。本研究發現，胼胝質在匍匐翦股穎感染褐斑病初期，經低濃度乙烯合成促進劑ACC處理后，尚未大量沉積，隨著發病時間的延長，胼胝質開始顯著增加，但在褐斑病侵染后期，胼胝質的沉積在乙烯合成抑制劑和促進劑之間無顯著差異。

綜上所述，在BDO誘導的匍匐翦股穎ISR抗病反應中，乙烯信號分子影響了AsA-GSH循環以及胼胝質的沉積，誘導了匍匐翦股穎的抗病性。一定濃度的乙烯誘導了AsA和GSH含量的明顯上升，但其如何與乙烯信號分子協同作用，參與到匍匐翦股穎ISR抗病反應，尚有待于進一步研究。同時在匍匐翦股穎感染褐斑病初期，乙烯分子能夠有效誘導胼胝質沉積，但在侵染后期乙烯分子無顯著影響?？芍蚁┬盘柗肿訉﹄蓦召|沉積的影響是短期效應，一定濃度的乙烯分子能有效增強匍匐翦股穎植株對褐斑病的抵御能力。研究結果為探清匍匐翦股穎ISR抗病響應中ET信號分子如何調控抗病生理特性提供了理論基礎。