茅蒼術規模化組培快繁體系的建立

宋 剛，徐 銀，史 俊，謝正林

(江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400)

茅蒼術[Atractylodeslancea(Thunb.) DC.]，又名南蒼術、茅術、京蒼術，是菊科蒼術屬多年生草本植物，地下根狀莖經炮制作蒼術入藥。茅蒼術在中國分布廣泛，主產于江蘇、浙江、山東、江西、廣東、安徽、湖北、四川等地區[1-2]。江蘇茅山地區是茅蒼術道地藥材的中心產區，品質優良的茅蒼術根莖斷面有黃白色或灰白色和棕紅色油腺，習稱“朱砂點”[3]。在傳統用藥中，茅蒼術揮發油部分是主要藥用成分，主要包括β-桉葉醇、茅術醇、蒼術素、蒼術酮等，藥理藥性研究表明茅蒼術具有胃腸促進、抗缺氧、抗血糖、抗菌、抑制癌細胞增殖等作用[4]。體外細胞試驗表明，茅蒼術還具有一定的抗HIV病毒的活性[5]。除藥用外，茅蒼術還可用作各種飲料的添加劑和加工工藝品香包[6]。傳統生產可以利用茅蒼術種子和根莖進行繁殖，但存在種子生命力較差、繁殖系數較低；根莖繁殖時根莖需求量大、品質易退化等弊端。通過組培快繁技術能在短期內獲得大量優質無菌苗，滿足生產種苗需求。還能與生物技術育種結合選育高產優質的新品種，開辟新的藥用資源，并對緩解供需矛盾，保護野生茅蒼術資源具有重要的意義。對茅蒼術組培快繁技術的研究已有報道[6-8]，所用外植體包括根莖側芽、胚根、胚軸、子葉、葉柄、葉片，通過直接誘導叢生芽和先誘導愈傷再分化成叢生芽再生途徑實現再生。在配方研究方面，李文等[9]采用正交設計篩選了南蒼術最佳增殖和生根培養基配方及試管苗移栽基質配方。王紅娟等[10]通過均勻設計對茅蒼術增殖和生根培養基進行了優化，并比較了不同移栽基質的效果。

前人研究中試驗組合數偏少，研究目的偏向于再生體系建立，適合規模化工廠化生產的技術體系并未明確。本研究采用全面試驗組合，旨在篩選適合生產用的高效增殖和生根培養基、同時對茅蒼術組培苗多次繼代，闡明其叢芽增殖變化規律，為實現茅蒼術種苗工廠化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茅蒼術植株2011年11月采集自句容茅山，經江蘇省中醫院主任中藥師宋金斌鑒定為野生茅蒼術；將其移栽于江蘇農林職業技術學院植物園。收集茅蒼術種子，經無菌播種[11]培養成無菌苗(圖1-A)；選取葉色濃綠、植株粗壯的無菌苗作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 增殖培養 接種前于超凈工作臺上剪去茅蒼術無菌苗葉片、根系，將胚軸形成的芽苗切割成單芽，接入不同芽增殖培養基，每瓶接1個單芽，每處理接6瓶，重復3次。培養6周后統計芽增殖系數。

1.2.2 生根培養 取株高達到5 cm以上，葉片挺拔、葉色濃綠的單株健壯的幼苗，接種至不同生根培養基，每瓶接1株，每處理接6瓶，重復3次。培養3周后調查統計生根率、平均生根數、根系長勢情況。

1.2.3 馴化與移栽 挑選葉片數多于8片、不定根數多于15、苗高超過6 cm的壯苗，擰松瓶蓋先在溫室放置2 d，隨后在溫室自然光下鍛煉1周，移栽前打開瓶蓋，倒入少量水保持植株不萎縮。取出試管苗注意不要傷到根，洗凈培養基后定植于72孔穴盤，2周后調查其移栽成活率。

1.2.4 培養基與培養條件 按表1所示，設計了16種增殖培養基和8種生根培養基。所有培養基均分裝在組培瓶中，于122 ℃條件下滅菌20 min。培養時培養室溫度控制在(25±2) ℃，日光燈光照強度2000～2500 lx，時間12 h/d[12-13]。

表1 培養基配方設計

1.2.5 數據統計與分析 按下列公式計算各指標：

增殖系數=增殖叢生芽數/接種瓶數

生根率=(生根苗數/接種瓶數)×100%

平均生根數=總生根數/接種瓶數

移栽成活率=(移栽成活苗數/移栽總苗數)×100%

利用Excel 2007和SPSS 20.0對統計的數據進行分析，多重比較采用Duncan’s檢驗法。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑對不定芽增殖的影響

單芽接入培養基中，約1周可見新芽出現，陸續長出新葉。隨后有更多叢生芽產生，最后形成叢苗(圖1-B)。如表2所示，除了6、8、12、13、14、15號這6種培養基未能誘導增殖出叢生芽，其余9種培養基均能誘導分化形成數量不等的叢生芽，其中3號培養基叢生芽增殖系數達到15，為所有培養基中最高，并與其他處理間差異顯著(P<0.05)。

添加4.0 mg/L 6-BA的培養基，雖然分別與4種不同濃度NAA搭配組合，但各組合都未有叢芽分化形成，說明在培養基中過高濃度的6-BA會抑制茅蒼術單芽分化形成叢芽，相對較低濃度的6-BA與NAA組合能夠誘導出叢生芽。而在形成叢芽的培養基當中，添加了1.0 mg/L的和部分2.0 mg/L 6-BA的培養基有少量同時誘導產生了愈傷組織，這些愈傷組織呈綠色到棕色，位于叢芽基部胚軸位置，隨著叢芽增多而增大。愈傷組織的產生并未明顯影響到叢生芽的分化。

對各培養基中叢苗長勢進行比較發現，1～4號培養基中叢苗比較健壯，而其他培養基中叢苗長勢偏弱，葉色偏淺，部分甚至發黃。

2.2 不同繼代次數對叢苗增殖的影響

將3號培養基增殖的叢苗分成單芽(圖1-C)繼代培養于相同培養基，每隔4周繼代一次，連續繼代8次。每代調查每瓶平均葉片數、平均苗高和增殖系數，并描述芽苗生長狀況。結果如表3所示，8代繼代苗每瓶苗平均葉片數在34～43之間。平均苗高在5.95～6.33 cm之間，各代間差異不顯著。增殖系數前3代與后5代差異顯著(P<0.05)；從第4代開始增殖系數趨于穩定，到第6代達最高值12.33。在增殖苗長勢方面，1～5代苗的生長狀況正常，葉形挺拔、葉色濃綠、株型勻稱規則；從第6代起出現少部分苗長勢偏弱，有葉萎縮卷曲、葉色偏淡轉黃現象，但沒有白化、玻璃化、黃化苗出現。

表2 不同植物生長調節劑組合對茅蒼術叢芽增殖的影響

注：不同小寫字母表示差異達到P<0.05的顯著水平。下同。

表3 不同繼代次數對茅蒼術叢苗增殖的影響

2.3 不同培養基對生根的影響

取生長8周的一致單株壯苗(圖1-D)，接入生根培養基培養3周后調查生根狀況，結果如表4、圖1-E所示。根系長勢采用“+++”(表示根長度長于8 cm、數量達到15根以上)、“++”(根系長度長于5 cm，數量10根以上)和“+”(根系長度短于5 cm，數量較少)三等級表示。在8種生根培養基中，3、4、5、6號培養基的生根率、平均生根數、根系長勢都與其余4種差異明顯，顯然不適合作為茅蒼術工廠化生產的生根培養基。1號對照與2、7、8號培養基比較，生根率都為100%，但平均生根數顯著減少，根系長勢也偏弱。

2、7、8號培養基分別添加活性炭、NAA及活性炭+NAA，它們的平均生根數分別為24.9、25.7和24.8，彼此差異不顯著，根系長勢也一致，都到達+++級別。

表4 不同類型培養基對茅蒼術生根的影響

2.4 組培苗的移栽

茅蒼術組培苗移栽基質采用泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1，高壓蒸汽滅菌處理。移栽后穴盤置于溫室，相對濕度保持80%以上，每周噴施0.1%多菌靈一次，常規管理移栽苗。兩周后以產生新葉植株為移栽成活判斷標準(圖1-F)。經調查成活率達95%，后續可移入盆栽(圖1-C)，一年后可地栽(圖1-H)。

A.無菌苗;B.叢生芽;C.單芽;D.試管苗；E.生根苗；F.移栽苗；G.盆栽苗；H.地栽苗圖1 茅蒼術高效快繁技術體系

3 討論與結論

巢建國等[7]研究發現茅蒼術胚軸分化能力最強，每段能產生8～10個新芽。王紅娟等[10]研究茅蒼術胚軸叢芽增殖最佳培養基，平均增殖系數為(10.0±0.71)。植物生長調節劑是植物組織培養器官分化的關鍵因素，形成器官的類型由培養基中不同植物生長調節劑的相對質量濃度控制，而不是由這些物質的絕對質量濃度決定[14]。本研究使用6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.15 mg/L的植物生長調節劑組合，芽增殖系數達到最高15.0，高于前人的研究結果，這說明這2種植物生長調節劑的相對濃度比例較合適，對芽的增殖起到較好的促進作用。

利用此增殖培養基對茅蒼術叢芽進行繼代培養，共繼代到8代。試驗結果顯示，4代以后增殖系數顯著增加，一直到第8代，并且繼代苗高度和葉片數各代間差異不大，叢苗生長狀況良好。通常在種苗快繁與保存時，無菌繁殖體系在培養基中激素的作用下，分生組織不斷分化，能連續多代增殖。曹孜義等[15]對葡萄離體培養48～80代后發現增殖倍數并未降低。蘋果新梢外植體繼代培養100余次，其器官再生能力沒有顯著變化[16]。本試驗結果與上述研究結果相似，表明在茅蒼術工廠化快繁生產中能使用此培養基多次繼代，在組培苗生根前獲得充足的中間繁殖體。

培養基中添加活性炭能為根的生長發育營造近似自然生長條件下的黑暗環境，吸附培養基中有毒副作用的物質，降低鹽離子濃度，因而活性炭可以促進不定芽生根和生長。張素勤等[17]研究發現1/2MS中添加0.2%～0.3%活性炭能明顯促進非洲菊不定芽生根，縮短生根時間，增加根數和根長。在本試驗中，1/2MS添加0.5%活性炭與未添加活性炭平均生根數比較差異顯著，說明添加活性炭有利于茅蒼術生根。此外，1/2MS添加0.15 mg/L NAA的生根效果與添加活性炭類似，但兩者均添加的培養基中并沒有表現出明顯增加、乃至倍增的生根效果，原因有待進一步深入研究。我們認為，與在生根培養基中添加生長素相比，添加活性炭取材容易、操作簡便、無激素積累，更適合在工廠化生產中推廣使用。

本研究以茅蒼術無菌苗為材料，分別從16種增殖培養基和8種生根培養基中篩選出適合工廠化大規模生產用培養基。叢芽增殖培養基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，可進行多次繼代增殖。生根培養基為：1/2MS+0.5%活性炭。采用泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的基質移栽成活率達95%。利用該體系可進行茅蒼術組培苗高效擴繁，為規模化生產提供技術支持。