沙田柚乙烯應(yīng)答因子的鑒定和生物信息學(xué)分析

李璐璐，陳玉梅，羅 瓊，李惠敏，秦新民

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

乙烯是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的氣體激素[1]，它參與花的發(fā)育、促進果實的成熟、組織的衰老和各種脅迫反應(yīng)等生理活動，可在自身發(fā)育以及各種環(huán)境因子所誘導(dǎo)下產(chǎn)生。茄科植物中,乙烯對花發(fā)育的調(diào)控受到乙烯合成關(guān)鍵酶基因影響[2]。而乙烯應(yīng)答因子(ethylene response factor, ERF)是植物中存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，對植物生長發(fā)育過程中面臨到的一些脅迫應(yīng)答起著重要的作用[3-4]。雷明等[5]證明了ERF轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯調(diào)控路徑，促進蜻蜓鳳梨花柄的發(fā)育。王萱[6]發(fā)現(xiàn)柑橘乙烯誘導(dǎo)酯酶基因可被乙烯和傷害處理誘導(dǎo)而大量表達，在柑橘抗逆反應(yīng)中起重要作用。其機理為植物細(xì)胞的乙烯受體蛋白與植物體產(chǎn)生的乙烯結(jié)合誘導(dǎo)促EIN3/EIL1基因的表達，從而促發(fā)乙烯的下游反應(yīng)，EIN3基因編碼蛋白則通過結(jié)合到ERF基因的啟動子區(qū)，調(diào)控后者的表達，使得植物體產(chǎn)生應(yīng)答響應(yīng)。其中，EIN3基因的高表達及其蛋白的積累在植物雌配子發(fā)育中有重要作用[7]。

沙田柚屬蕓香科柑桔屬，在我國廣東、廣西的栽培面積較大。沙田柚具有配子體自交不親和性，在自然授粉情況下坐果率極低，生產(chǎn)中必須進行人工授粉，較費時費力，不利于生產(chǎn)。植物自交不親和性是指植物不能正常地完成受精作用過程，主要表現(xiàn)在雄株產(chǎn)生的花藥不能與雌株的柱頭特意進行識別從而萌發(fā)，或者花藥可以正常萌發(fā)但是花粉管卻不能正常地生長，或者是花粉管可以正常生長，但是兩個配子不能完成精卵融合過程[8]。目前，沙田柚配子體自交不親和性的研究在細(xì)胞學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)等方面取得了一定進展[9-14]，但尚未見乙烯應(yīng)答因子基因與沙田柚自交不親和性相關(guān)的研究報道。本研究在對沙田柚自交和異交花柱進行轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，獲得了沙田柚乙烯應(yīng)答因子基因(Unigene16183_All)，并對該基因在未授粉、自花與異花授粉1～3 d花柱中的表達，以及其編碼蛋白質(zhì)的理化特征進行分析，旨在為深入研究乙烯應(yīng)答因子基因的功能和沙田柚自交不親和的分子機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為沙田柚未授粉、自花與異花授粉花柱，處理與采集方法按文獻[15]的報道進行。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、建庫和測序 按改良Trizol 法對總RNA進行提取[16]，轉(zhuǎn)錄組的建庫和測序參照文獻[15]。

1.2.2 序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建 乙烯應(yīng)答因子基因序列和編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析分別采用DNAMAN、NetPhos 3.1 Server、SOPMA等軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學(xué)分析

基因(Unigene16183_All)序列全長為1013 bp (GenBank登錄號：MG905213)。通過生物信息學(xué)軟件DNAman以及NCBI網(wǎng)站上的NCBI ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對序列進行分析，該序列的開放閱讀框共有498 bp，編碼166個氨基酸(圖1)。

圖1 Unigene16183_All序列和推測氨基酸序列

2.2 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

運用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對該蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)的預(yù)測分析。結(jié)果顯示：該基因編碼的蛋白質(zhì)分子分子式為C800H1269N235O255S6，分子質(zhì)量為18.45 kDa，等電點PI為7.90。構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸中，蘇氨酸(Ser)所占比例最大，為14.5%，半胱氨酸(Cys)所占比例最少，僅為0.6%。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為72.06(>40)，屬于不穩(wěn)定蛋白。其中，該蛋白質(zhì)攜帶的負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)與正電荷氨基酸(Arg+Lys)總數(shù)分別為19和20。利用DNAman軟件對該蛋白質(zhì)進行疏水性分析，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出該基因編碼的肽鏈中疏水性最大值約為2.14，位于第121位氨基酸，最小值約為-3.05，位于第14、15位氨基酸。該蛋白質(zhì)疏水性平均值為-0.561，鑒定該蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

圖2 Unigene16183_All蛋白疏水性分析

2.3 功能結(jié)構(gòu)域分析

將該基因編碼的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search進行鑒定，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有一個與AP2 superfamily蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，如圖3所示。

圖3 Unigene16183_All蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4 跨膜預(yù)測

運用TMHMM-2.0對該蛋白的跨膜區(qū)域進行預(yù)測。結(jié)果表明該蛋白質(zhì)位于膜外，不屬于跨膜蛋白，結(jié)果預(yù)測如圖4所示。

圖4 Unigene16183_All跨膜區(qū)預(yù)測

2.5 蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化位點采用在線預(yù)軟件NetPhos3.1Server進行預(yù)測。結(jié)果顯示，Unigene16183_All基因編碼的蛋白質(zhì)，共有24個可能的磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點共有18個，分別位于蛋白質(zhì)的第5、16、40、45、46、55、77、128、130、139、149、151、152、153、154、157、163和165位；蘇氨酸(Thr)磷酸化位點共5個，分別位于蛋白質(zhì)的第44、91、155、158和160位；酪氨酸(Tyr)磷酸化位點僅1個，為蛋白質(zhì)的第22位。可知此蛋白質(zhì)的磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，其次為蘇氨酸和酪氨酸。

2.6 蛋白質(zhì)二級以及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

運用在線軟件SOPMA 對該基因編碼的蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，結(jié)果表明，在該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋所占比例為30.72%，延伸鏈18.07%，無規(guī)則卷曲47.59%，β轉(zhuǎn)角占3.61%(圖5)。

h:α-螺旋；c:無規(guī)則卷曲；e:延伸；t: β折疊圖5 乙烯應(yīng)答因子蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對乙烯應(yīng)答因子氨基酸序列三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果表明：該基因編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)含有1個α-螺旋和2個β-折疊，螺旋和折疊之間由無規(guī)則卷曲連接(圖6)。

2.7 同源性分析

沙田柚乙烯應(yīng)答因子基因編碼的氨基酸序列與其他13種植物乙烯應(yīng)答基因編碼蛋白的同源性分析結(jié)果表明，沙田柚乙烯應(yīng)答因子基因編碼的氨基酸序列與甜橙(Citrussinensis,XP-006467696.1)和克萊門柚(Citrusclementina,XM-006449381.1)的同源性分別為100%和98%。此外，DNAman構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明沙田柚乙烯應(yīng)答基因編碼的蛋白質(zhì)與克萊門柚和甜橙有很近的親緣關(guān)系，屬于同一個進化分支(圖7)。

圖6 乙烯應(yīng)答因子蛋白的三級結(jié)構(gòu)

Unigene16183_All(沙田柚，KU517851)，Citrussinensis(甜橙，XP_006467696.1)，Citrusclementina(克萊門柚，XM_006449381.1)，Heveabrasiliensis(橡膠樹，XP_021692420.1)，Ricinuscommunis(蓖麻,XP_002522517.1)，Vemiciafordii(光桐，APQ474444.1)，Vemiciamontana(皺桐，APQ47365.1),Medicagotruncatula(蒺藜苜蓿,XP_003593690.1),Phaseolusvulgaris(菜豆,XP_007148088.1)，Lycopersiconesculentum(番茄,AY192370.1)，Solanumtuberosum(馬鈴薯,JN125861.2),Malusdomestica(蘋果,GU732428.1)

圖7基于氨基酸序列的乙烯應(yīng)答因子蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

AP2/ERF是轉(zhuǎn)錄因子基因家族中比例最大的一類轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和是否出現(xiàn)其他DNA結(jié)合域，劃分為AP2、ERF、RAV和soloist 4個家族[17-18]。其中AP2蛋白家族在調(diào)控植物花的發(fā)育過程中具有非常重要的功能，參與花分生組織的建立、花器官發(fā)育和果實成熟[19-22]。同時，AP2轉(zhuǎn)錄因子對種子和果實的發(fā)育也有重要的影響。其方式為通過對胚、胚乳和種皮發(fā)育的影響從而調(diào)控種子的大小[23-24]。Chung等[25]發(fā)現(xiàn)番茄SLAP2a基因在花和葉中不表達，而僅在其果實發(fā)育和成熟過程中表達，存在明顯的組織器官特異性。RNAi技術(shù)抑制番茄的SLAP2a基因表達的結(jié)果發(fā)現(xiàn)植株體內(nèi)的乙烯含量增加，而果實提前成熟。Bartley等[26]對番茄不同的成熟期AP2轉(zhuǎn)錄因子的表達進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在綠色果實、轉(zhuǎn)色期，以及紅色果實中均有表達，但轉(zhuǎn)色期的表達量最高。

通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守域預(yù)測和氨基酸序列同源性分析，沙田柚的乙烯應(yīng)答因子基因編碼的蛋白質(zhì)含有一個AP2 superfamily蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與蕓香科的甜橙和克萊門柚的AP2蛋白相似性很高，相似度分別為100%和98%。表明了本研究所獲得的Unigene16183_All為沙田柚乙烯應(yīng)答因子基因。

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)表明，沙田柚乙烯應(yīng)答因子基因在自交和異交花柱中的轉(zhuǎn)錄水平存在差異。利用 RPKM(Reads Per Kb per Million reads)[27]對該基因在不同樣品中的表達進行分析，在未授粉花柱中的表達量為0.71，自交1 d的花柱中的表達量迅速上升(13.99)，自交2 d的表達量持續(xù)升高(31.08)，在自交3 d的表達量達到了最高(48.42)。 而在異交1 d的花柱中，該基因的表達快速升高(16.80)，異交2 d時持續(xù)升高(36.82)，但異交3 d的表達量則快速下降(18.98)。 以RPKM 值取2的對數(shù)值[log2(RPKM)] 對未授粉/自交1 d、未授粉/異交1 d、自交1 d/異交1 d花柱、自交2 d/異交2 d花柱和自交3 d/異交3 d花柱中該基因的表達水平進行統(tǒng)計，其log2(RPKM ratio)分別為 -4.30、-4.56、0.264、0.245、-1.35。以上數(shù)據(jù)表明，沙田柚AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子與授粉有關(guān)，無論是自交授粉或異交授粉，其表達出現(xiàn)急劇增加。鑒于目前尚未見AP2/ERF與植物授粉和自交不親和關(guān)系的研究報道，其在沙田柚自交不親和性反應(yīng)中的作用機理有待深入研究。