超聲處理對蝦青素穩定性和抗氧化性的影響

張麗瑤，張華敏，王志祥，崔志芹

（中國藥科大學，江蘇 南京 210009）

蝦青素（3, 3’-二羥基-4, 4’-二酮基-β, β’-胡蘿卜素）屬類胡蘿卜素，其分子具有高度對稱結構，有4種幾何異構體[1-2]，即全反式、9-順式、13-順式和15-順式異構體，見圖1。室溫條件下，蝦青素在丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜、乙醇及其他非極性溶劑中的溶解性較好[3]。蝦青素有很強的抗氧化性[4-5]，具有抗腫瘤、保護心血管及增強免疫力等多方面生理功能[6-7]。

蝦青素分子結構中含很多長共軛不飽和雙鍵，因此性質極不穩定，對光、熱、氧都比較敏感[8-11]。王紅霞等[12]從溫度、光照、氧氣、保存條件等方面考察了蝦青素的穩定性，采用分光光度法進行含量測定，結果顯示光照、溫度、氧氣均會影響蝦青素的穩定性，其中氧氣的影響最為明顯。

超聲提取技術是近年應用于有效成分提取分離的一種常用手段。超聲波產生的空化效應、熱效應及攪拌作用等，都可加速有效成分進入溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時間，節約溶劑。本文研究了超聲波對蝦青素穩定性的影響，并在此基礎上進行了蝦青素1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除實驗，考察了蝦青素抗氧化性的變化，為蝦青素的超聲提取提供依據。

圖1 蝦青素4種幾何異構體

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10A TVP高效液相色譜儀（日本島津公司）；HH-4日本數顯恒溫水浴鍋（國華電器）。

1.2 材料

蝦青素對照品（純度98 %，南京澤朗）；5 %蝦青素（南京澤朗）；DPPH（純度＞97 %，Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦）；二氯甲烷（AR，江蘇強盛功能）。

2 方法

2.1 色譜條件

Diamond C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:甲醇:二氯甲烷:乙腈:水=85:5:5:5；流速為0.8 ml/min；檢測波長470 nm。

2.2 蝦青素穩定性考察

精密稱取5 %的蝦青素300 mg于50 ml棕色量瓶中，加適量二氯甲烷，室溫超聲約30 s使之溶解，加二氯甲烷稀釋至刻度；0.45 μm濾膜過濾，精密移取8.0 ml濾液至棕色量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，作為處理前蝦青素樣品溶液待用。

精確移取10 ml蝦青素樣品溶液于大口樣品管中，將超聲發生器的探針插入蝦青素液面以下，超聲功率分別設為200，300，500 W，每組樣品超聲時間分別為0.5，1，2 h，各組的超聲條件均為超聲0.3 s，間隔0.3 s。冷卻定容至刻度，HPLC分析，考察不同超聲功率和超聲時間對蝦青素穩定性的影響。每個實驗重復測定3組。

2.3 DPPH自由基清除實驗

精密稱取DPPH 25 mg于50 ml棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，作為DPPH反應液。精確稱取5 %蝦青素0.63 g于100 ml棕色量瓶中，加甲醇約80 ml，室溫水浴超聲溶解30 s，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；0.45μm濾膜過濾，作為1#樣品溶液。取1#樣品溶液25 ml，超聲處理2 h后，定容至刻度，得2#溶液。將蝦青素1#、2#樣品溶液分別與上述DPPH反應液按1:1混合，37 ℃水浴恒溫避光反應30 min，采用HPLC分析反應前后DPPH的峰面積變化，計算出相應DPPH濃度，按下式計算DPPH自由基的清除率。

式中：C0為反應前DPPH濃度（mg/ml）；Ci為反應后DPPH濃度（mg/ml）。

3 結果與分析

3.1 HPLC色譜圖

蝦青素對照品為全反式結構，保留時間約12 min，色譜圖見圖2。5 %蝦青素中除了全反式蝦青素外，還含9-順、13-順和15-順3種異構體，保留時間分別約17.5，19，21.5 min。

圖2 蝦青素對照品色譜圖

3.2 超聲對蝦青素穩定性的影響

蝦青素溶液經500 W探針式超聲處理后HPLC譜圖見圖3，蝦青素樣品溶液經超聲后，溶液中蝦青素各異構體的濃度見表1。按下式計算異構體轉化率。

式中ΔC為光照后全反式異構體減少的濃度（μg/ml）；ΔC9為光照后9-順式異構體增加的濃度（μg/ml）；ΔC13為光照后13-順式異構體增加的濃度（μg/ml）；ΔC15為光照后15-順式異構體增加的濃度（μg/ml）。

由圖3和表1可見，蝦青素溶液經超聲處理后，全反式異構體的濃度大幅度降低，9-順式和13-順式異構體濃度均有所增加，其中13-順式異構體含量升高較多，15-順式異構體含量很低，幾乎未檢測到。我們認為超聲處理使蝦青素降解為其他成分，同時也引起了異構體之間的相互轉化。

圖3 500W探針超聲處理2 h HPLC色譜圖

表1 探針式超聲前后蝦青素異構體的濃度

由表1可見，隨超聲時間的延長，全反式蝦青素的降解也愈顯著；且隨著超聲功率的增大，全反式蝦青素的濃度也逐漸下降。超聲促使全反式蝦青素的降解這一結論在文獻中也有提及。趙立艷等[13]研究發現，超聲使全反式蝦青素降解為未知的無色物質，并且這種降解作用隨著超聲時間的延長和超聲功率的提高而加劇。

3.3 DPPH清除實驗

3.3.1 DPPH檢測方法 在評價抗氧化劑的DPPH清除率時，分光光度法是一種常用方法，但并不適用于有色樣品的測定，因為樣品的顏色會對測定結果造成干擾。本文采用HPLC 測定溶液中DPPH濃度。為分析方便，DPPH分析條件與蝦青素一致，檢測波長為517 nm。DPPH的保留時間約5.2 min。所得DPPH對照品色譜圖見圖4。

圖4 DPPH對照品色譜圖

3.3.2 DPPH清除實驗 分別測定蝦青素1#，2#樣品溶液對DPPH自由基的清除率，并分析了各樣品反應前后溶液中9-順式和13-順式異構體的含量，結果見表2。實驗發現，蝦青素經探針式超聲處理后，雖然全反式的濃度有所降低，清除率卻達100 %，且反應后樣品溶液中幾乎檢測不到9-順式和13-順式異構體，說明這兩種異構體雖然濃度很低，但都參與了DPPH自由基的清除反應。

表2 DPPH清除實驗結果

4 結論

作為一種具有高抗氧化活性的類胡蘿卜素，蝦青素極不穩定，易發生降解和異構體之間的轉化。蝦青素溶液經探針式超聲后，全反式異構體的濃度大幅降低，而9-順式和13-順式異構體濃度均有所增加，超聲不僅使蝦青素降解為其他成分，同時也引起了異構體之間的相互轉化。在DPPH自由基清除實驗中，經超聲處理后的蝦青素清除能力大大增強，達100 %。