柱前衍生化HPLC測定鹽酸阿比多爾顆粒中有關物質二甲胺

王立立，張 云，張相軍

（山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

鹽酸阿比多爾有干擾素作用，通過抑制流感病毒脂膜與宿主細胞的融合而阻斷病毒復制，對具有A、B型抗原的流感病毒的抗病毒活性最顯著；除具有殺滅病毒作用外，還有免疫調節作用，激活吞噬細胞，提高機體對病毒的抵抗能力；是用于治療A、B型病毒引起的流感和急性呼吸道病毒性感染的新型抗病毒藥物[1-3]。

二甲胺是鹽酸阿比多爾的合成原料，在體內易與亞硝酸根反應形成致癌性的N-亞硝基胺毒性物質，從而對人體健康造成危害[4-6]。為了保證藥品安全性，有必要對鹽酸阿比多爾顆粒中的潛在雜質二甲胺進行控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260）；Mettler Toledo XS205電子分析天平（梅特勒-托利多）；DKB-2006低溫恒溫槽（上海精宏）；TGL-16gR離心機（上海安亭）。

1.2 試藥

鹽酸二甲胺對照品（批號：H1527047，純度＞99.0 %），2,4-二硝基氟苯（批號：20160702，梯希愛，純度＞99.0 %）均購自阿拉??；鹽酸阿比多爾顆粒（批號：160928、161102、170416，石家莊四藥）；三乙胺（批號：20160203，國藥集團化學試劑公司）；乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Pinnacie DB C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1 %磷酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測波長：380 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 衍生試劑 精密量取1 ml 2,4-二硝基氟苯置入100 ml量瓶，用乙腈溶解并稀釋至刻度，臨用現配。

2.2.2 二甲胺對照溶液 取鹽酸二甲胺對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度為5 μg/ml（以二甲胺計）二甲胺對照品貯備液。精密量取該貯備液1 ml至10 ml量瓶，加入100 μl三乙胺和1 ml生試劑，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度，搖勻，過濾，作為二甲胺對照溶液和系統適用性溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取鹽酸阿比多爾粉末適量（約相當于鹽酸阿比多爾10 mg），置入10 ml量瓶，加5 ml乙腈，超聲10 min后，加入100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度，搖勻，過濾。

2.2.4 空白溶液 分別精密量取5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑至10 ml量瓶中，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性 分別取2.2項下空白溶液，對照溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，二甲胺衍生物峰與距離最近的衍生試劑所產生的峰分離度大于1.5，理論塔板數以二甲胺衍生物計算不低于3000，滿足定量要求。見圖1。

圖1 鹽酸阿比多爾顆粒色譜圖

2.3.2 定量限 精密量取二甲胺對照品貯備液60 μl置入10 ml量瓶，依次加入5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻后，60 ℃加熱30 min，冷卻后用乙腈定容至刻度，搖勻，進樣。按S/N=10計算定量限為0.30 ng。

2.3.3 線性關系的考察 取二甲胺對照品貯備液依次稀釋，獲得二甲胺濃度分別為0.03，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 μg/ml系列對照品溶液，按2.2項下對照溶液制備方法，2.1項下色譜條件，分別進樣，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標，以對照溶液的濃度X（μg/ml）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=167.59X- 0.4745，r=0.9999。

2.3.4 精密度試驗 取2.2.2項下對照溶液，按2.1項下色譜條件，連續進樣6次，記錄峰面積，二甲胺峰面積的RSD為0.6 %（n=6），結果表明方法精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算二甲胺的含量平均值為0.023 %，RSD為1.3 %（n=6）。

2.3.6 中間精密度試驗 由不同實驗人員采用相同操作方法，使用兩臺不同的高效液相色譜儀，重復上述重復性項下試驗，儀器A（Agilent 1260）、B（島津20A）測得二甲胺的含量平均值為0.025 %，RSD為3.1 %（n=12）。

2.3.7 耐用性試驗 通過改變流動相初始比例、0.1 %磷酸溶液的濃度、流速、柱溫、波長、不同品牌的色譜柱等參數的變化，系統適用性溶液的分離度均大于5.0，表明該方法的耐用性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取批號為160928的供試品，精密稱定（約相當于鹽酸阿比朵爾10 mg），共9份，置入10 ml量瓶，分別加入乙腈5 ml，超聲10 min，每個量瓶中依次加入對照溶液0.8，1，1.2 ml各3份，分別加100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻后，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容。取續濾液進樣，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 樣品測定結果

2.4 樣品含量測定 取本品3批（批號：160928、161102、170416），按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，3批樣品中二甲胺的含量分別為：0.023 %，0.021 %，0.025 %。

3 討論

3.1 衍生條件選擇 本試驗驗證了不同的水浴溫度（50，60，70 ℃），不同的衍生時間（20，30，40 min），不同的三乙胺體積（80，100，120 μl）對衍生結果的影響，最后確定水浴溫度為60 ℃時，加入100 μl三乙胺反應30 min最合適。

3.2 本文制定的柱前衍生化-HPLC能準確地測定鹽酸阿比朵爾中二甲胺的含量，方法簡便，重現性好，為制劑的質量可控性提供了科學的檢驗方法。