人參多糖3種給藥途徑大鼠體內藥動學特征比較

房紹英，馬 河，侯重文，邵華榮，程艷玲

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

人參（Ginseng radix et rhizoma）為五加科多年生草本植物人參（Panax ginsengC. A. Mey.）的根，是我國傳統名貴中藥。人參多糖為人參的主要活性成分之一，具有免疫調節[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等多方面藥理作用。近年對人參多糖的研究熱點主要涉及分離純化、功能活性評價和作用機制探討[4-7]，藥動學特征則未見報道。目前國內僅有肌肉注射的人參多糖注射液上市，其他給藥途徑劑型有待開發。本課題組前期采用生曬參提取獲得人參多糖，經指紋圖譜鑒定其組成包括半乳糖醛酸、葡萄糖（S）、半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖；多糖重均分子量為2705，分子量分散系數1.69。本試驗研究人參多糖靜脈注射、肌肉注射及口服3種給藥途徑在SD大鼠體內的藥動學特征，計算肌注途徑和口服途徑的生物利用度，為后期人參多糖的臨床應用開發提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；AUW-120D型電子分析天平（日本島津公司）；MS3型漩渦混懸器（德國IKA公司）；Thermo Sorvall 21R高速微量冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀（德國默克公司）；ACS-JJ-Tiger電子計價秤（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

人參多糖（山東省藥學科學院，批號：20160501，含量：94.27 %）；二水合磷酸二氫鈉（國藥集團，批號：20160106）；高氯酸（天津鑫源化工，批號：20150905，含量：70.0 %～72.0 %）；肝素鈉注射液（山東魯抗辰欣藥業公司，批號：1609286421）；水為超純水。

1.3 實驗動物及飼養環境

SPF級SD大鼠18只，雌雄各半，體重范圍230～260 g。由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）2014 0007。飼養條件：SD大鼠于SPF級環境飼養，每籠5只。室溫19～26 ℃，濕度40 %～70 %，日溫差≤4 ℃，換氣次數8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2014 0008。

2 方法

2.1 動物給藥與樣品采集

18只SD大鼠按體重隨機分成3組，每組6只，雌雄各半。禁食約12 h后，分別靜脈注射、肌肉注射、口服給予600 mg/kg人參多糖（以半乳糖醛酸計）。各組藥前采血，靜脈注射組于藥后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，肌肉注射組于藥后0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，口服組于灌胃給藥后0.5，1，2，4，6，8 h采血約0.5 ml，置于肝素鈉抗凝的離心管中經4 ℃，12 000 r/min離心10 min，制備血漿，-20 ℃冷凍保存待測。

2.2 生物樣本測試

色譜柱：TSK-GEL G3000PWXL（7.8 mm×300 mm，5 μm），流動相：0.05 mol/L NaH2PO4，流速：0.6 ml/min，柱溫：35 ℃，檢測器：RID-20AT示差折光檢測器，檢測池溫度：40 ℃，進樣體積：20 μl。樣本處理：取血漿樣品100 μl置于1.5 ml離心管中，加入2 mol/L高氯酸溶液50 μl，渦旋2 min后11 000 r/min離心10 min，取上清，進樣檢測。

2.3 統計學處理

根據各組別人參多糖血藥濃度-時間數據，利用DAS3.2.6藥動學程序計算半衰期（t1/2）、達峰時間（Tmax）、表觀分布容積（Vd）、清除率（CL）、達峰濃度（Cmax）、平均滯留時間（MRT）、藥時曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）等，并利用SPSS16.0對主要藥動學參數進行統計學分析。與靜脈注射AUC0-t比較，計算肌肉注射和口服給藥途徑的絕對生物利用度。

3 結果

3.1 樣本測試方法考察

大鼠空白血漿色譜圖及實際測試血漿樣本色譜圖見圖1。由表1可見，在該分析條件下空白SD大鼠血漿中的內源性物質不干擾人參多糖的測定。人參多糖的保留時間約11.8 min。

圖1 大鼠空白血漿色譜圖（A）及大鼠靜脈注射給予人參多糖注射液后血漿樣本色譜圖（B）

表1 靜注組、肌注組人參多糖藥動學參數

該方法在25～800 mg/L范圍內線性良好（Y=211.850X-4193.44，r2=0.9929），定量下限為25 mg/L（5平行樣本分析，RSD為3.84 %，RE為14.75 %）。在高、中、低3個濃度下，回收率分別為78.35 %±7.85 %，84.25 %±5.23 %，80.86 %±5.4 %，RSD小于10.02 %。在高、中、低3個濃度下考察3批次精密度與準確度，人參多糖在每一濃度水平的批內精密度（RSD）小于3.95 %，相對誤差（RE）為-13.39 %～5.00 %；批間精密度（RSD）小于8.24 %，相對誤差（RE）為-11.62 %～-2.30 %。在低、高2個濃度下，人參多糖血漿樣本3次凍融穩定性RE分別為102.12 %±6.76 %，90 %±5.31 %，RSD小于6.62 %；-2 0 ℃凍存7 d穩定性R E分別為9 8.4 6 %±9.67 %，105.46 %±4.92 %，RSD小于9.82 %。

3.2 人參多糖藥動學研究結果

靜注組、肌注組SD大鼠分別靜脈注射、肌肉注射600 mg/kg人參多糖后，繪制平均血藥濃度-時間曲線圖（見圖2）；人參多糖主要藥動學參數見表1。口服組SD大鼠灌胃給予600 mg/kg人參多糖后，血藥濃度均低于檢測限，未被檢出。靜注組與肌注組相比，t1/2z差異無統計學意義（P＞0.05）；Vd、MRT和CL均低于肌注組（P＜0.01）；同時Cmax和AUC0-8h均明顯高于肌注組（P＜0.01）。根據肌注組及靜注組AUC0-8h平均值計算肌肉注射方式的絕對生物利用度為27.46 %。

圖2 靜注組（A）及肌注組（B）SD大鼠分別給予600 mg/kg人參多糖注射液后平均血藥濃度-時間曲線（n=6）

4 討論

藥動學研究的前提是建立靈敏可靠的藥物分析方法。多糖類藥物結構的特殊性及生物體內大量內源性相似多糖的干擾，使該類藥物的分析方法不同于傳統的化學藥品，檢測難度大、需解決的問題多。目前用于多糖類藥物的血藥濃度檢測方法主要有以下幾種：同位素標記示蹤法[8]、生物檢定法[9]、色譜法[10]、熒光標記[11]等。多糖類藥物無紫外吸收基團和熒光發射基團，質譜法也不適用于多糖的檢測。本研究采用分子排阻色譜法聯合示差折光檢測器，建立了有效可靠的分析方法，該方法樣本處理簡單，重復性良好，準確率高，為后續人參多糖藥動學研究提供良好支持，但此分析方法仍有其應用的局限性，由于示差折光檢測器檢測靈敏度低，此方法的檢測限尚不能滿足口服途徑人參多糖在大鼠體內的藥動學研究。

分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制，血漿樣本存在大量內源性多糖，因此色譜分離容易存在內源性干擾，樣本處理方法是影響色譜分離效果的重要因素。本試驗分析方法建立時，對人參多糖血漿樣本的處理方法進行了反復摸索，嘗試了不同濃度硫酸銨、乙酸鋅和高氯酸等多種蛋白質沉淀方法，最終選擇2 mol/L高氯酸溶液渦旋沉淀去除蛋白質，此方法人參多糖回收率在78 %以上，且色譜峰無內源性干擾。

本試驗初期參考人參多糖注射液臨床使用劑量，根據體表面積折算為大鼠給藥劑量，但給藥后血藥濃度均無法檢出，故提高多倍劑量并參考毒理試驗劑量，最終擬定給藥劑量為600 mg/kg。該劑量下，靜脈注射組峰濃度可達4000 mg/L以上，而口服組峰濃度低于25 mg/L，不足靜注組的0.625 %，其原因可能由于人參多糖原型難吸收或在消化道內被降解，使藥物濃度低于本方法的檢測限而無法檢出。比較肌肉注射組和靜脈注射組藥動學參數，t1/2無明顯差異，靜注途徑Vd、MRT和CL低于肌注組，Cmax和AUC0-8h均明顯高于肌注組。結果顯示，肌肉注射人參多糖在體內分布更廣，存留時間更長，但肌肉注射的生物利用度較低，吸收進入體循環的藥物相對量僅為27.46 %，且本課題組相關藥效學試驗發現，人參多糖肌肉注射途徑存在明顯肌肉刺激性。本研究提示人參多糖開發為靜脈注射劑型具有優越性。