多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選芩龍降壓膠囊的提取工藝

王奎鵬，許紅瑋，李學(xué)林

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

芩龍降壓方為河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的有效驗(yàn)方，由龍膽草、黃芩、地龍、白芍、生地和川芎等13味中藥組成。全方龍膽草、黃芩共為君藥，有清熱利濕、活血止痛和解毒的功效[1-3]；臣藥地龍、白芍養(yǎng)其陰血，舒肝理氣，活血祛瘀，滋陰養(yǎng)肝為主[4]，生地、川芎[5]行其血滯，活血行氣，滋肝養(yǎng)腎。全方共奏清熱解毒，調(diào)理臟腑經(jīng)絡(luò)氣血陰陽(yáng)以達(dá)降壓的作用。藥理研究表明[6-8]：龍膽苦苷、黃芩苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷是龍膽草、黃芩、白芍、生地中主要特征性成分，藥理活性顯著，且與龍膽草、黃芩、白芍、地黃的功效具有相關(guān)性，故本實(shí)驗(yàn)以龍膽苦苷、黃芩苷、芍藥苷和毛蕊花糖苷含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選芩龍降壓膠囊的水提工藝，為該制劑的工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站；Sartorius CP225D電子天平（北京賽多利斯），Hk250型科導(dǎo)臺(tái)式超聲波清洗器（上海科導(dǎo)），LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭）。

龍膽草、黃芩、白芍、地龍等藥材均來(lái)源于本院中藥飲片庫(kù)房，經(jīng)鑒定均符合《中國(guó)藥典》2015 年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定；龍膽苦苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110770～201314）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110715～201318）；芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供鑒別用，批號(hào)：110738～201337）；毛蕊花糖苷對(duì)照品（四川維克奇，純度大于98 %）。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。芩龍降壓膠囊提取液：以龍膽苦肝、黃芩苷、芍藥苷和毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)正交表進(jìn)行加熱回流得到正交試驗(yàn)提取液。

2 方法與結(jié)果

2.1 龍膽苦苷的含量測(cè)定[9]

2.1.1 色譜條件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色譜柱，流動(dòng)相乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91，v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算不低于3000，見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品5.01 mg，置入25 ml棕色量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取正交試驗(yàn)提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇約9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

圖1 芩龍降壓膠囊提取液中龍膽苦苷HPLC圖譜

2.1.4 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件分別進(jìn)樣1，2，3，4，5和6 μL測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=56 100X-33 500（r=0.9999），線性范圍0.2004～1.2024 μg。

2.2 黃芩苷的含量測(cè)定[10]

2.2.1 色譜條件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色譜柱，流動(dòng)相：以乙腈-0.1 %磷酸水溶液（21:79，v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于3000，見(jiàn)圖3。

圖 2 芩龍降壓膠囊提取液中黃芩苷HPLC圖譜

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品5.46 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取正交試驗(yàn)提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇約9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10，12 ml，分別置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=3 185 782X-242 551（r=0.9999），線性范圍0.1092～1.3104 μg。

2.3 芍藥苷的含量測(cè)定[9]

2.3.1 色譜條件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色譜柱，乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91，v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于3000，見(jiàn)圖2。

圖3 芩龍降壓膠囊提取液中芍藥苷HPLC圖譜

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品5.06 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取正交試驗(yàn)提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 1，2，3，5，7，9 μl，分別置入25 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=1 131 538X+22 645（r=0.9998），線性范圍0.2024～1.8216 μg。

2.4 毛蕊花糖苷的含量測(cè)定[11]

2.4.1 色譜條件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色譜柱，流動(dòng)相：以乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，0～30 min（16:84，v/v），30～50 min（21:79，v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算不低于3000，見(jiàn)圖4。

圖 4 芩龍降壓膠囊提取液中毛蕊花糖苷HPLC圖譜

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品5.23 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密量取正交試驗(yàn)提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇約9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 1，2，3，5，7，10 ml，分別置入10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=60 422 678X-232.30（r=0.9999），線性范圍 0.02092～0.2092 μg。

2.5 提取工藝優(yōu)選

選擇加水量、提取次數(shù)及提取時(shí)間為考察因素，以龍膽苦肝、黃芩苷、芍藥苷和毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W）為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，按處方量稱取各藥材，共9份，置平底燒瓶中，按L9(34)正交表進(jìn)行加熱回流提取。因素水平見(jiàn)表1。為客觀反映各因素間的關(guān)系及因素水平對(duì)水提液質(zhì)量的影響，擬采用綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平

表 2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果/mg·g-1

表 3 綜合評(píng)分方差分析

由表3極差R值可見(jiàn)，各因素作用主次為C（提取次數(shù)）＞B（提取時(shí)間）＞A（加水量）。表3方差分析結(jié)果表明，C因素各水平之間有顯著性差異（P＞0.05），B因素各水平之間具有差異（0.05＜P＜0.1），A 因素各水平之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），綜上所述，最終提取工藝確定為：A1B3C3，8倍量水，提取3次，每次2 h。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)本處方中君藥和臣藥中的有效成分含量數(shù)據(jù)采用綜合加權(quán)評(píng)分法[12]處理，綜合指標(biāo)（overall desirability，OD）的計(jì)算公式為：

OD=0.3×W1/Wmax1×100+0.3×W2/Wmax2×100+0.2×W3/Wmax3×100+0.2×W4/Wmax4

其中Wn為正交試驗(yàn)提取液量，Wmax為正交試驗(yàn)提取液量最大值。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取處方量藥材共3份，每份125 g，按最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算提取物中龍膽苦苷、黃芩苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.03 %，12.88 %， 1.55 %，0.78 %。RSD分別為1.12 %，0.62 %， 1.47 %，1.83 %，表明優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 本處方中藥成分多，具有多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)本處方中君藥和臣藥中的有效成分含量數(shù)據(jù)以O(shè)D綜合考察各個(gè)指標(biāo)，以綜合指標(biāo)進(jìn)行直觀分析各因素間的關(guān)系及因素水平對(duì)水提液質(zhì)量的影響。據(jù)指標(biāo)因素對(duì)水提工藝影響的貢獻(xiàn)差異給予分配不同的權(quán)重系數(shù)，即龍膽苦肝的含有量為0.3，黃芩苷的含有量為0.3，芍藥苷的含有量為0.2，芍藥苷的含有量為0.2，再進(jìn)行加權(quán)求和，按下式綜合評(píng)分，以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳中藥復(fù)方提取工藝。

3.2 中藥成分復(fù)雜，復(fù)方中極性相似成分眾多。按2015 年版《中國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下條件測(cè)定發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷、黃芩苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷目標(biāo)峰均受到干擾，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例，最終將龍膽苦苷、芍藥苷流動(dòng)相調(diào)為：乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91），黃芩苷流動(dòng)相調(diào)為：乙腈-0.1 % 磷酸水溶液（21:79）；毛蕊花糖苷流動(dòng)相調(diào)為：以乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，0～30 min（16:84，v/v），30～50 min（21:79，v/v）；流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)依次為270，230，280，334 nm，分離度明顯改善。

3.3 本制劑以湯劑形式在我院臨床應(yīng)用多年，臨床效果較好，但是傳統(tǒng)煎煮法會(huì)造成龍膽草、黃芩等有效成分提取率低、提取不完全甚至有效成分被破壞等缺點(diǎn)，因此，本實(shí)驗(yàn)以該制劑中龍膽苦苷、黃芩苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷作為提取評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了多成分、多靶點(diǎn)綜合控制該制劑的質(zhì)量。該工藝穩(wěn)定可靠，含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，對(duì)進(jìn)一步提高該制劑的臨床療效和合理用藥有一定的指導(dǎo)意義。