大蒜辣素和阿藿烯的制備工藝研究

唐鐵鑫，劉 慧，鄧禮荷，邱新華

（肇慶醫學高等?？茖W校 藥學系，廣東 肇慶 526040）

關鍵字：大蒜辣素；阿藿烯；合成；純化

大蒜（Allium sativumL.）廣泛用于藥品、食品和飼料添加劑[1-3]。大蒜中蒜氨酸被蒜酶催化分解產生大蒜辣素（allicin），再分解成阿藿烯（ajoene）等含硫有機化合物，有抗病原微生物、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用[4-6]。美國、英國及歐盟藥典以蒜氨酸或大蒜辣素作為大蒜粉的含量測定指標[1,7]?！吨袊幍洹凡捎么笏馑兀╝lltride）作為大蒜含量測定指標，但該指標存在異議[1,8]。直接以大蒜為原料制備分離大蒜辣素、阿藿烯，成本高、難度大[4,7,9-11]。以烯丙基二硫化物為原料可合成大蒜辣素[4,10]，用大蒜辣素可合成阿藿烯[4]，本文研究相關工藝改進。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；LC 10A高效液相色譜儀（日本島津）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（金壇晶玻實驗儀器廠）；CPA225D十萬分之一精密分析天平（德國賽多利斯）；PURELAB flex3超純水儀（英國ELGA）；CXG-A電腦恒溫層析柜（廣州恒創）；RE52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TF-FD-1L實驗室真空冷凍干燥機（上海田楓）。

1.2 藥品與試劑

80 %烯丙基二硫化物（allyl disulfide）、對羥基苯甲酸丁酯（butyl parahydroxybenzoate，分析對照品，純度＞99.5 %）（上海阿拉?。治黾兗姿帷⒈宜?、30 %過氧化氫、氫氧化鉀、丙酮、甲醇、二氯甲烷、正己烷（廣州化學試劑廠），色譜純的甲醇和乙腈（瑞典Oceanpak），超純水（實驗室制備）。大蒜（市售），研碎后凍干制成。

2 方法與結果

2.1 大蒜辣素和阿藿烯的檢測

參考《英國藥典》大蒜粉中大蒜辣素含量測定方法[12]檢測大蒜辣素，但在等度洗脫9 min后增加一個梯度洗脫過程，檢測弱極性物質且避免前一次樣品分析殘留的成分干擾下一次樣品分析。

色譜柱為安捷倫ZORBAX色譜柱-SB-C18（5μm，150 mm×4.6 mm），流動相A為1 %甲酸水溶液，流動相B為純甲醇，0～9 min，60 % B；9～12 min，線性增至80 % B；12～18 min，80 % B；18～20 min，線性遞減至60 % B；20～22 min，60 %B。流速0.8 ml/min，紫外檢測波長254 nm，進樣量5 μl。

取對羥基苯甲酸丁酯對照品20.5 mg，精密稱定，加甲醇-水（1:1）溶液溶解轉移入100 ml量瓶，稀釋定容，作為內標溶液。按1 mg 對羥基苯甲酸丁酯對應8.65 mg大蒜辣素計算含量[12]。按照文獻[12]方法制備大蒜粉供試品溶液，合成大蒜辣素樣品和合成阿藿烯樣品按各試驗項下的具體方法制備。

主要樣品和對照品的色譜圖見圖1，測得每1 g大蒜粉中含有3.92±0.01 mg（n=2）大蒜辣素。

圖1 實驗中主要樣品和對照品的色譜圖

2.2 大蒜辣素合成研究

取烯丙基二硫化物0.7 ml溶于冰乙酸，定容至5 ml，置冷?。? ℃）中冷卻。在快速攪拌下，將5 ml過氧化氫乙酸溶液（0.7 ml 30 %過氧化氫溶解于5 ml冰乙酸中）逐滴加入烯丙基二硫化物乙酸溶液中反應，反應完后繼續在冷浴下快速攪拌4 h，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入100 ml量瓶，稀釋定容至刻度；再分別吸取0.2 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml內標溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液進行測定。另外一組試驗中，反應完后繼續于20 ℃快速攪拌，分別于1，2，4，6 h準確取樣0.2 ml，分別加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度；再分別吸取5 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml內標溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，然后測定。

結果，冷浴中反應4 h反應生成大蒜辣素129.3±7.0 mg；于20 ℃分別反應1，2，4，6 h，分別生成大蒜辣素：147.6±1.1 mg，207.3±2.2 mg，271.3±10.0 mg，353.1±2.6 mg（n=2）。以時間（T/h）為橫坐標、產物質量（M/mg）為縱坐標對數據進行曲線擬合，得到直線擬合方程為M＝39.55×T＋116.3，R2＝0.9905，反應符合零級反應動力學方程。反應6 h后，烯丙基二硫化物基本消耗完畢（圖1 B）。

2.3 大蒜辣素純化制備

取烯丙基二硫化物0.7 ml，按2.2項于20 ℃反應6 h合成大蒜辣素粗品，參照文獻[9]，在快速攪拌和冰浴冷卻條件下，通過滴入氫氧化鉀溶液（2.15 g氫氧化鉀溶于蒸餾水，定容至2.5 ml）中和反應混合物，如有鹽析出，加適量水溶解，分別加入等體積的正己烷、二氯甲烷各萃取一次；將未萃取的溶液、正己烷萃取后溶液和二氯甲烷萃取后溶液各取0.2 ml，分別加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度測定。

測得的色譜圖見圖2。正己烷基本將未反應的原料和保留時間7.5 min后的成分萃?。▓D2 B）；二氯甲烷萃取后，溶液中大蒜辣素的含量降低（圖2 C）。萃取前溶液的大蒜辣素峰的峰面積為27 221.4（按照峰面積歸一化法，大蒜辣素峰的峰面積占66.7 %），正己烷萃取后減少至25 085.6，二氯甲烷萃取后減少至4421.2。正己烷萃取一次使溶液中大蒜辣素減少約7.8 %，而二氯甲烷萃取一次使溶液中大蒜辣素減少約82.4 %。因此，可用正己烷除去未反應的原料，用二氯甲烷萃取純化大蒜辣素。

取二氯甲烷層1 ml減壓揮去溶劑，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度測定，測得的色譜圖見圖1 E，按照峰面積歸一化法，大蒜辣素峰的峰面積占92.2 %。

圖2 液-液萃取處理對合成大蒜辣素的純化作用

2.4 大蒜辣素熱解制阿藿烯的研究

文獻[4]將大蒜辣素按10 %的體積比溶于40 %丙酮水溶液中，于64 ℃反應4 h制取阿藿烯。參考該條件，將0.1 ml大蒜辣素按10 %體積比溶于溶劑中，分別進行以下單因素試驗。大蒜辣素分解產生阿藿烯的圖譜見圖1 C。

按照文獻[4]的反應溫度64 ℃，分別加熱1，2，4，6，8 h，反應后加甲醇-水（1:1）溶液溶解，移入10 ml量瓶，繼續稀釋定容至刻度；再分別吸取1 ml置入10 ml量瓶，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液進行測定。結果，阿藿烯峰生成量分別為：3.79±0.03，3.58±0.02，3.26±0.05，3.10±0.02，3.04±0.03 mg（n=2）。以時間（T/ h）為橫坐標、阿藿烯的生成量（M/mg）為縱坐標對數據進行曲線擬合，得到對數擬合方程為M＝-0.379 ln(T)＋3.807，R2＝0.9917，表明大蒜辣素于64 ℃很快生成阿藿烯，隨加熱時間增加，阿藿烯慢慢減少。

溶于40 %丙酮水溶液中，于30，40，50，60，80 ℃反應4 h。結果，阿藿烯生成量分別為：1.49±0.04，2.50±0.04，4.33±0.04，4.80±0.01，4.07±0.01 mg（n=2），60 ℃下反應生成量最高。

不加溶劑、溶于甲醇-水（1:1）水溶液、溶于甲醇中，于64 ℃反應4 h。結果，阿藿烯峰的峰面積分別為：1.25±0.06，3.51±0.01，5.75±0.03 mg（n=2）。

2.5 阿藿烯的純化制備

根據2.4項結果，選擇將0.1 ml大蒜辣素按10 %的體積比溶于甲醇中，在60 ℃下加熱1 h，用甲醇-水（1:1）溶液稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用反相高效液相色譜法分離制備阿藿烯。其中，色譜柱為Innoval C18半制備色譜柱（5 μm，100 ?，10 mm×250 mm），流動相為甲醇－水（6:4），紫外檢測波長254 nm，每次進樣量為100 μl。柱后收集富含阿藿烯的洗脫部分，加食鹽至成飽和溶液，以二氯甲烷為溶劑萃取，二氯甲烷層加無水硫酸鈉脫水，低溫減壓揮去溶劑。純化后的阿藿烯產品的色譜圖見圖1 F，按照峰面積歸一化法，阿藿烯峰的峰面積占98.8 %。經測定，產物的質譜ESI-MS MRM(+)：m/z234.9；紅外光譜γ/cm-1：3080～2905, 1634, 1611, 1422, 1042 cm-1；核磁共振譜氫譜1HNMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.57 (d),5.9 (m), 5.4 (m), 5.2 (m), 3.5 (m), 3.38 (m)；核磁共振譜碳譜13CNMR （500 MHz，CDCl3）：δ134.58,132.47, 125.52, 123.77, 119.20,117.88, 54.79, 52.84,41.99，與文獻中阿藿烯波譜數據基本一致[4]。

3 討論

實測結果表明，大蒜凍干粉中大蒜辣素的含量不到0.4 %。用大蒜制備大蒜辣素，成本高、干擾成分多、分離純化較困難?；瘜W合成方法制備大蒜辣素，轉化率高、干擾成分少[4,10]。

將烯丙基二硫化物氧化成大蒜辣素的反應，文獻[10]報道13 ℃下反應呈零級反應動力學，20 ℃時也為零級反應。因此，在一定溫度下反應足夠時間，使原料反應完全，大蒜辣素不再增加；由于大蒜辣素不穩定，隨后會分解減少。文獻建議溫度為10～30 ℃，但冰浴中反應也產生了相當于20 ℃下三分之一的大蒜辣素，表明即使在低溫下也能反應生成產物。低溫下有利于避免分解，但反應時間長且溫度控制需增加設備和能耗，實際制備中可根據具體情況控制溫度和反應時間。

由于大蒜辣素易分解，分離純化成為制備較高純度大蒜辣素的關鍵。文獻中采用乙醚萃取大蒜辣素[10]，乙醚易燃易爆，接觸空氣會慢慢氧化成過氧化物，過氧化物不穩定，加熱易爆炸，要避光嚴封保存，而且屬于易制毒二類溶劑，因此試驗用二氯甲烷替代。通過液-液萃取方法，用正己烷除去未反應的原料，用二氯甲烷萃取富集大蒜辣素，取得較佳純化效果。由于用制備液相色譜法進一步制備成本高，大蒜辣素在除去溶劑的過程分解（結果表明，30 ℃下均分解產生阿藿烯），因此不再進一步純化。

大蒜辣素在不同溫度下，在不同溶劑中，甚至不加溶劑均分解產生阿藿烯等一系列產物。64 ℃下加熱，反應1 h產生的阿藿烯最多。但時間增加，阿藿烯的量下降較慢，表明阿藿烯穩定性較好。文獻[4]報道用40 %丙酮作為溶劑溶解大蒜辣素進行熱裂解，考慮到丙酮為易制毒溶劑，因此試驗不加溶劑、甲醇水溶液和甲醇進行反應，結果表明，甲醇中反應產量更高。文獻中熱裂解產生阿藿烯后，再以二氯甲烷為溶劑通過反復多次液-液萃取進行富集，揮去溶劑后再通過正相HPLC法制備[4-5]。由大蒜辣素液-液萃取試驗結果可見，二氯甲烷萃取并不能將阿藿烯與原料分開，而正相HPLC也不常用，因此，改用稀釋后直接通過反相HPLC法制備。

以烯丙基二硫化物合成大蒜辣素并進一步合成阿藿烯，條件要求不高，易于在實驗室開展。此法可用于為研究大蒜及其制品的質量控制和藥理研究提供標準物質。