基于DGT技術的土壤鉛生物有效性評價研究

代允超 張育林 呂家瓏

(1.西北農林科技大學資源環境學院， 陜西楊凌 712100； 2.農業部植物營養與農業環境重點實驗室， 陜西楊凌 712100)

0 引言

近年來，隨著工業和經濟的快速發展，帶來了嚴重的環境污染問題，土壤重金屬污染就是其中之一。土壤鉛(Pb)污染因其長期持久性和對生物體的不可逆影響，一直是當前研究的熱點之一[1]。研究表明，Pb單質雖不溶于水，但其化合物溶解性較強，會隨著食物鏈被植物、動物和人體吸收，對生態環境、食品安全和人體健康造成威脅[2]。為了確保農產品生產的安全性，對土壤中Pb的生物有效性評估尤為重要。目前關于評價土壤中Pb生物有效性的方法有很多，但還沒有一種方法被普遍接受和應用。

相關學者在評估土壤中重金屬的生物有效性方面也做了很多相關研究，傳統的評價重金屬的生物有效性方法包括同位素稀釋交換法、化學提取法和自由離子活度法等[3-5]。這些傳統方法多是以平衡理論為依據，沒能完全考慮重金屬離子在植物根-土壤界面處的消耗以及消耗后所誘導的土壤液相-固相間的離子補充[6]，化學提取過程難以避免重金屬離子的重新分配和再吸收，這可能導致結果誤差[7]。另外，重金屬在土壤中的生物有效性還與其在土壤中存在的形態、土壤性質及作物種類等有關。研究表明，土壤基本理化性質，如pH值、陽離子交換量(CEC)、粘粒含量和有機碳(OC)含量等都會影響植物的重金屬吸收[8-9]，當研究重金屬在土壤中的生物有效性時，要綜合考慮土壤性質對重金屬生物有效性的影響。

近年來，梯度薄膜擴散技術(DGT)被引入作為評估土壤中重金屬生物有效性的新型技術[10]。DGT技術的原理是基于菲克第一擴散定律，即在單位時間內通過單位垂直截面積的擴散物質流量與該截面處的物質濃度成正相關關系。DGT技術是一項模擬植物從土壤吸收重金屬的過程，并通過連續從土壤中吸收化學物質來評估生物有效性的技術。該技術不僅反映了土壤溶液中的重金屬含量，還能反映重金屬離子在從土壤固相向土壤液相間的動態供應，從而有效地測定土壤固相中重金屬向液相的動態補給的化學過程[11-12]。DGT 技術已經用于評價土壤或沉積物中植物對多種重金屬的生物有效性及吸收特性，如評價鎘(Cd)、砷(As)在黑麥草、甘蔗中的生物有效性，并取得了不錯的效果[11-16]。但也有學者研究發現，DGT在評價某些植物對某些重金屬生物有效性時效果并不好[17]。小白菜作為我國大量消費的蔬菜，其根系發達且莖部較短，對重金屬的吸收轉運能力較強[18]，小白菜的安全生產關乎人類健康，但在用DGT技術對小白菜中Pb的生物有效性評價上還沒有相關研究。

基于以上分析，本研究在我國15個省份采集不同理化性質的耕作土壤，外源添加重金屬Pb模擬Pb污染土壤，以小白菜為研究對象，通過盆栽試驗，比較DGT技術和傳統化學方法評價土壤中Pb的生物有效性。首先使用簡單回歸分析，得出植物Pb含量和各種評價方法測定的土壤Pb含量之間的線性相關關系，但簡單回歸分析不能反映土壤性質對Pb生物有效性的影響，然后將土壤性質納入回歸分析，通過逐步多元線性回歸來探討，得出小白菜Pb含量與土壤Pb含量、土壤性質之間的相關關系，建立融合土壤基本理化性質的逐步多元回歸模型方程，比較各方法評價土壤中Pb生物的有效性，為評價土壤Pb的生物有效性提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

采集我國15個省份理化性質差異較大的土壤，采樣深度為0～20 cm，土壤樣品風干后過20目尼龍篩，供土壤基本理化性質測定。分析方法參照《土壤農化分析》[19]。使用濕酸消解法(HNO3-HF-HClO4)對供試土壤樣品進行消解處理，浸提液使用原子吸收分光光度計(Hitachiz-2000型，日本)測量其中的總Pb含量。供試土壤基本理化性質見表1。

1.2 試驗布置和樣品分析

通過盆栽試驗，將外源Pb(硝酸鉛PbNO3)加入到15個省份的土壤樣品中(每盆裝2 kg土壤)。根據GB 15618—1995《土壤環境質量標準》[20]二級土壤標準限定的Pb含量，設置3個Pb處理：CK、T1、T2，外源添加Pb的量分別為0、200、400 mg/kg，每個處理做3次重復，將所有盆栽進行隨機排列，并置于自然條件下，老化3個月。在此期間，使用蒸餾水補水，使土壤含水率保持在田間最大持水量的80%。待土壤老化和均一化后，在每盆土壤中加入含有0.30 g N(尿素)、0.10 g P(Ca(H2PO4)2)和0.20 g K(K2SO4)的基肥。待種子萌發后，根據長勢，每盆將幼苗定苗成2株。整個生長期間用去離子水保持土壤含水率在田間最大持水量的80%左右，以保障小白菜的正常生長。

生長60 d后收獲小白菜，首先用自來水洗滌植物樣品，然后用去離子水洗滌，擦干，稱鮮質量。將洗凈的植物樣品90℃殺青后65℃干燥至恒質量，粉粹，在密封高壓系統下用HNO3-H2O2對植物樣品進行消化，然后用原子吸收分光光度計測量植物樣品中的總Pb含量。并將收獲小白菜后的土壤進行收集、風干，過2 mm尼龍篩，用于測定土壤各形態的Pb含量。

表1 供試土壤基本理化性質Tab.1 Basic properties of selected soil

注：土壤編號以pH值為序。

1.3 土壤中有效態Pb的測定方法

1.3.1DGT提取法

DGT裝置購自維申有限責任公司(中國南京)，并按照標準程序操作[21]。先將50 g過2 mm篩的風干土壤放入塑料盒中，加水使其保持最大持水量(MWHC)的60%條件下48 h，然后在保持80%MWHC的條件下保持24 h，使土壤呈黏糊狀且表面光滑。然后，將DGT裝置輕緩地壓入土壤表面，確保DGT濾膜與土壤充分接觸。在DGT浸提期間使溫度保持在(20±1)℃。放置24 h后，從土壤樣品中回收所有DGT裝置，用蒸餾水洗滌以除去粘附在裝置上的土壤顆粒，并將裝置拆分。將吸附膠用1 mL 1 mol/L硝酸洗脫24 h，稀釋待測。使用原子吸收分光光度計測量洗脫液中的Pb含量。

1.3.2土壤溶液法和一步提取法

土壤溶液Pb濃度根據傳統的離心法測定，在回收DGT裝置后，將土壤轉移到50 mL聚乙烯試管中并離心(5 000 r/min，15 min)以提取土壤溶液[22]，供測試使用。

3種傳統的一步提取法使用的浸提劑分別為提取物包括0.05 mol/L的EDTA、0.01 mol/L的CaCl2和0.11 mol/L的HAc，操作步驟：①EDTA，稱取土壤2.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL 0.05 mol/L的EDTA浸提劑，振蕩2 h，過濾[22]。②HAc，稱取土壤0.5 g于50 mL離心管中，加入20 mL 0.11 mol/L的HAc，振蕩16 h，過濾[23]。③CaCl2，稱取土壤2.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL 0.01 mol/L的CaCl2，振蕩3 h，過濾[24]。所有浸提液中Pb含量通過原子吸收分光光度計測定。

1.4 統計分析

DGT測量的Pb質量比為[12]

CDGT=MΔg/(DAt)

(1)

式中CDGT——DGT法測定的Pb質量比，mg/kg

M——浸提時間內Pb的累積質量，μg

Δg——擴散層的厚度，cm

D——擴散層中Pb的擴散系數，cm2/s

A——DGT吸附窗口的面積，cm2

t——DGT浸提時間，s

運用Excel 2003進行數據分析和圖表繪制，采用SPSS 23.0軟件進行差異顯著性分析和Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 外源Pb對小白菜生物量的影響

供試土壤性質變化差異很大，其中pH值范圍為4.90～8.80，陽離子交換量質量摩爾濃度范圍為8.70～31.11 cmol/kg，OC質量比范圍為6.78～20.70 g/kg，碳酸鈣質量比范圍為0～53.57 g/kg，粘粒質量分數范圍為6.66%～42.91%。由圖1(圖中不同土壤各處理間的相同小寫字母表示在0.05水平下差異不顯著，不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著)可以看出，15種土壤上3個處理的小白菜生物量的平均值為35.66 g，其中CK、T1和T2處理的平均生物量分別為36.37、36.28、34.33 g。與CK相比，添加Pb的處理T1和T2之間的生物量在p<0.05水平下沒有顯著差異，說明在這兩種Pb處理水平下未對小白菜的生長造成顯著的促進或抑制作用。

圖1 15種不同土壤中小白菜生物量的比較Fig.1 Comparison of plant biomass in 15 different soils

2.2 小白菜對Pb的富集量

由圖2可以看出，在所有15種土壤中，小白菜中的平均Pb質量比為0.291 mg/kg，CK、T1、T2處理的小白菜中的總Pb質量比范圍分別為0.025～0.181 mg/kg(平均值0.103 mg/kg)，0.208～0.416 mg/kg(平均值0.304 mg/kg)和0.404～0.571 mg/kg(平均值0.466 mg/kg)，3個處理間比較，T2處理小白菜Pb質量比在p<0.05水平下顯著高于T1，T1處理小白菜Pb質量比在p<0.05水平下又顯著高于CK。酸性土壤(A～G)和堿性土壤(H～O)土壤的平均小白菜Pb質量比分別為0.326、0.260 mg/kg，這可能是由于堿性土壤中Pb的生物有效性較酸性土壤低。土壤C、F、G的平均小白菜Pb質量比分別為0.297、0.265、0.267 mg/kg，顯著低于酸性土壤(A～G)小白菜Pb質量比的平均值(0.326 mg/kg)，這可能是由于這3種酸性土壤中的OC質量比較高(分別為19.87、20.70、19.05 mg/kg)，增加了土壤對重金屬的吸收，從而降低了Pb在土壤中的生物有效性。

圖2 15種不同土壤中小白菜對Pb的吸收量Fig.2 Pb uptake by plants grown in 15 different soil

2.3 小白菜中Pb含量與土壤中Pb含量的相關性

用DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法分別測量的小白菜中Pb質量比和土壤Pb質量比之間的關系如圖3所示。EDTA、HAc、CaCl2方法測定土壤Pb質量比范圍分別為：8.7～87.94 mg/kg (平均值44.61 mg/kg)、0.47～27.05 mg/kg (平均值10.06 mg/kg)、0.50～8.78 mg/kg (平均值4.06 mg/kg)，說明EDTA對土壤Pb具有最強的浸提能力，其次是HAc，最后是CaCl2。

DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法在評價小白菜中Pb生物有效性的能力各不相同，線性回歸分析的決定系數R2分別為：0.97、0.92、0.88、0.80、0.78、0.72，由此可知，各方法評價小白菜對Pb的生物有效性順序由大到小為：DGT法、土壤溶液法、EDTA法、 HAc法、CaCl2法、全量法。

2.4 小白菜富集Pb的預測模型

通過逐步多元線性回歸，土壤性質(pH值，OC含量、CEC含量、CaCO3含量、粘土含量、氧化鐵含量和氧化鋁含量)和土壤Pb含量作自變量，小白菜中的Pb含量為因變量，對不同土壤測定方法(DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法)測量的土壤Pb含量進行逐步多元線性回歸，得到的預測模型見表2(Cplant為小白菜Pb質量比，CDGT、CSol、CEDTA、CHAc、CCaCl2、CTotal分別表示DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法測定的土壤Pb質量比，CH+為土壤pH值，COC為土壤有機碳質量比)，可以看出，綜合考慮土壤理化性質的影響后，基于6種分析方法提取的土壤有效態Pb所構建的多元回歸模型均呈顯著或極顯著回歸關系，且Pb在土壤中的生物有效性與土壤中的Pb含量呈正相關，而與土壤pH值和OC含量呈負相關。通過逐步多元線性回歸，將土壤理化性質歸入預測方程，提高了各方法小白菜Pb含量與土壤Pb含量之間的相關關系，通過比較圖3和表2可以看出，除DGT方法的R2與簡單線性回歸相比保持相同外，土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和總量法在將土壤pH值和OC含量加入后，較簡單回歸分析的R2分別從0.92、0.88、0.80、0.78、0.72提高到0.94、0.90、0.85、0.83、0.78。

圖3 小白菜Pb質量比和不同方法測得土壤Pb質量比之間的關系Fig.3 Relationships between plant and soil Pb concentrations

預測方程R2pCplant=0.156CDGT-0.0660.97<0.01Cplant=0.1617CSol-0.013CH+-0.005COC+0.1140.94<0.01Cplant=0.0865CEDTA-0.013CH+-0.003COC+0.0720.90<0.01Cplant=0.1134CHAc-0.014CH+-0.004COC+0.1360.85<0.01Cplant=0.1361CCaCl2-0.017CH+-0.006COC+0.1490.83<0.01Cplant=0.0026CTotal-0.034CH+-0.005COC+0.3500.78<0.05

注：p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著，下同。

表3為不同分析方法提取的土壤有效態Pb含量、pH值和OC含量在回歸方程中與小白菜Pb含量相關關系的顯著性差異分析結果?？梢钥闯?，土壤pH值和OC含量顯著影響土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法和全量法，但是對DGT法沒有顯著影響。綜合來看，與簡單線性回歸結果類似，逐步多元線性回歸的決定系數R2由大到小依次為：DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法、全量法。DGT法所構建的預測模型決定系數較其他5種傳統分析方法更高，且不受土壤理化性質的影響，是一種預測小白菜Pb生物有效性的較優方法。

表3 回歸方程中各系數的顯著性檢驗(p)Tab.3 Significant difference tests between factors in linear regression models (p)

3 討論

幾種單一浸提劑中，EDTA的浸出能力最強，其次是HAc，CaCl2浸提能力最弱，其原因可能是EDTA是一種較強的非專性螯合劑，能夠提取的重金屬形態包括水溶態、可交換態、礦物態和有機結合態；HAc是一種酸性提取劑，主要提取的重金屬形態包括水溶態、可交換態和碳酸鹽結合態；而CaCl2是中性鹽提取劑，只能提取可交換態金屬[25-26]。簡單線性回歸和逐步多元線性回歸都表明，與傳統的提取方法相比，DGT技術提供了一種能更好評估Pb生物有效性的方法。雖然單一的化學提取法作為利用率較高的評價方法相對比較成熟，但其存在一定的不科學性，如EDTA因其強螯能力較強，可將有機或殘渣態等對生物有效性無貢獻的形態提取出而導致所測結果偏大；HAc自身屬弱酸性，可能對土壤結構產生破壞而使提取值與真實值存在差異；中性鹽CaCl2利用靜態離子交換原理，測定的可交換態金屬易于被植物吸收利用，但土壤中有部分生物可利用的重金屬(如土壤溶液或顆粒中不穩定的礦物態) 可能未被交換提取出來，導致不能正確評估土壤中重金屬的生物有效性[21]。

土壤理化性質會影響重金屬在土壤中的生物有效性，研究表明，土壤pH值和OC含量會影響重金屬在土壤溶液中的生物有效性以及其在液相和固相之間的分布[27-29]。降低土壤pH值通常會使土壤中Pb的移動變強。因此，與酸性土壤相比，堿性土壤對Pb具有更強的緩沖能力，有研究表明，茶葉、冬小麥Pb含量與土壤pH值呈負相關[30-31]。土壤OC含量也會影響植物對Pb的吸收，因為OC可以將土壤中的重金屬吸附在土壤膠體中，降低被植物吸收的量[8]。因此，Pb在pH值和OC含量較高的土壤中生物有效性較低。土壤性質參數，如pH值、OC含量、CEC含量和粘土含量可能影響Pb在土壤中的生物有效性[31]。傳統的提取方法沒有完全考慮土壤特性對重金屬生物有效性的影響，因為它們不包括植物吸收重金屬的動力學過程，因此只反映土壤金屬的平衡狀態[13]。本研究表明，傳統的提取方法評價Pb的生物有效性時受土壤pH值和OC含量的影響最大，在將土壤性質納入回歸方程后，植物中重金屬含量和土壤重金屬含量的決定系數顯著增大，且模型回歸關系極顯著。因此，當這些傳統的測定技術用于評價重金屬的生物有效性時，應當把土壤性質的影響考慮進來，以前的研究也有類似的結果[32-33]。多元回歸分析表明，在預測Pb生物有效性時，DGT技術優于傳統的提取方法，且不受土壤理化性質影響。TIAN等[13]通過多元回歸分析，得出DGT技術包含了一些公認的影響重金屬在土壤中生物有效性的因素，如pH值、CEC含量、OC含量等，且DGT技術幾乎不受土壤基本性質的影響。宋寧寧等[14]在研究黑麥草鎘(Cd)生物有效性時發現，DGT技術綜合了土壤性質對土壤有效態Cd含量的影響，其所構建的方程也幾乎不受土壤性質的影響。DGT裝置由濾膜、擴散膜和吸附膜組成，由DGT的測定過程和原理可以知道，它先將土壤溶液中的重金屬吸附到擴散膜上，然后擴散膜上的重金屬再被吸附膜吸附測定，所以通過吸附膜測定的重金屬含量是從擴散膜上擴散得到的，故其不受土壤性質的影響。

本研究表明，與傳統評價方法相比，DGT在評價土壤重金屬上效果較優。SONG等[34]采用硝酸銨提取、EDTA提取等多種傳統的形態分析方法和DGT技術研究Elsholtziasplendens和Silenevulgaris在30種不同類型土壤中生長對銅吸收的有效性，研究表明，DGT提取的有效態銅含量與植物體內的銅含量的相關性明顯優于全量法、EDTA法、土壤溶液法等傳統方法。TIAN等[13]研究水稻及其根際土壤，利用土壤溶液法、HAc提取、CaCl2提取和DGT技術分析水稻根際中鎘、銅、鉛和鋅的生物有效態含量，結果表明，DGT測定的根際土壤重金屬含量與水稻中重金屬含量的相關性比其他方法都好。王芳麗等[35]利用DGT方法和傳統的化學方法對廣西環江流域甘蔗根際土中Cd的生物有效性進行研究時發現，DGT法較傳統化學方法能更好地預測甘蔗對Cd的生物有效性。ZHAO等[36]在歐洲18種性質不同的土壤上研究重金屬銅對大麥根長度和西紅柿生長的影響，發現在評價銅生物有效性上，DGT方法效果較土壤溶液法和自由離子活度法更優。NOLAN等[12]利用DGT法對小麥中的 Zn、Cd和Pb的生物可利用性進行了評價，結果表明DGT法可以很好地預測Zn、Cd 和Pb在植物中的累積。前面的研究雖然對Pb的生物有效性有所關注，但是土壤重金屬生物有效性受土壤性質和作物種類的影響，小白菜作為我國大量消費的蔬菜之一，與其他植物對Pb的吸收轉化特征有所差異，小白菜對重金屬的富集能力較強[18]，而前面的研究較少關注，因此本研究選擇小白菜為研究對象，研究結果具有較強的實用價值。

DGT之所以表現出較好的效果，與DGT的測定原理分不開，DGT技術基于動力學原理，考慮了元素在環境中的強度、容量及擴散速率，DGT技術測定的有效態濃度不僅包括土壤溶液中的重金屬，還包括測量期間從土壤固相動態釋放的重金屬含量[11]。植物對重金屬的吸收導致根部附近土壤溶液中的重金屬濃度下降，并促使土壤顆粒態重金屬補充給土壤溶液，這個動態反應過程對于重金屬的生物有效性評價是不可忽略的，DGT可很好地模擬植物根系對重金屬的吸收過程。Pb從固相到液相的動態交換過程也是影響小白菜Pb吸收的重要因素，隨著浸提時間的進行，DGT裝置表面附近的土壤溶液中的Pb濃度也隨之降低，并在土壤液體和DGT擴散凝膠中產生擴散梯度，進而產生從土壤固相到土壤液相的離子通量，這個過程與植物根在土壤中吸收重金屬時發生的過程相同。

4 結論

(1)植物對Pb的吸收量與土壤中Pb含量呈正相關，與土壤pH值和OC含量呈負相關。

(2)傳統技術在評價小白菜Pb含量和土壤Pb含量之間關系時，受土壤pH值和OC含量的影響，因此，當使用傳統方法評估小白菜對Pb的生物有效性時，應考慮土壤pH值和OC含量等土壤因素。

(3)各評價方法預測Pb生物有效性的相關性由大到小順序為：DGT法、土壤溶液法、EDTA法、HAc法、CaCl2法、全量法。與傳統的化學提取技術相比，DGT技術能更好地評價Pb污染土壤中小白菜對Pb的生物有效性，且不受土壤理化性質的影響，是一種有前途的評價方法。