富血小板血漿聯合骨碎補對兔前交叉韌帶重建術后腱骨愈合及生物力學的影響*

李煒峰，占 龍，李張生，李小峰，楊 淵

1．廣西中醫藥大學(南寧 530001)，2．廣西骨傷醫院(南寧 530012)，3．廣西醫科大學附屬瑯東醫院(南寧 530012)

主題詞 骨碎補 富血小板血漿/治療應用 前交叉韌帶 骨折愈合 生物力學現象 兔

前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)是膝關節重要的靜力和動力性穩定結構，由縱行排列的膠原纖維束構成，并在較大的功能束內形成緊密的簇狀結構。ACL損傷后難以自愈，易常造成嚴重膝關節不穩，繼發半月板損傷和骨關節炎。目前多建議行手術重建ACL[1]。重建后腱骨愈合情況是手術成功的關鍵因素，因此，如何促進重建術后腱骨愈合也成為當前研究的熱點。骨碎補是骨傷科常用的藥物，中醫認為其具有補益肝腎，強筋接骨，通絡止痛的功效，可改善骨代謝，因此常用于骨折，骨質疏松等疾病的治療，效果確切[2-3]。富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)是自體靜脈血經離心后獲得的含多種生長因子的血液制品，這些因子在肌腱愈合中可促進細胞增殖、膠原合成、炎性趨化[4]。本研究在兔行ACL重建術后在骨髓道中注入PRP并口服骨碎補，同時與對富血小板血漿組、骨碎補組、空白組相比，術后12周取材行Micro-CT掃描及三維重建，測量骨隧道內口擴大寬度及腱骨界面處骨密度(Bone mineral density，BMD)并行生物力學測定，評估各組對前交叉初帶重建后腱骨愈合及生物力學的影響。

材料和方法

1 實驗動物 本研究共使用 72 只骨骼成熟的新西蘭白兔，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，許可證號 ：SYXK(桂)：2014-0003，雌雄不限，6月齡，體質量約 3 kg，根據國際實驗動物科學理事會關于實驗室動物的護理和使用指南進行喂養，將它們飼養在單獨的籠中，標記并允許自由移動、自由進食與飲水，在實驗開始之前實驗動物在籠子里至少喂養 14 d，以馴化達到實驗條件。

2 儀器與試劑 臺式離心機(LD5-2A 型，北京醫用離心機廠)，骨碎補(廣西骨傷醫院藥劑科提供。水煎濃縮成含藥物濃度1 g/ml的藥液備用)，青霉素，電鉆，2 mm克氏針，戍巴比妥，4%多聚甲醛，0.5%碘伏，酒精，數碼相機，自動剃毛機，Skyscan 1176 Micro-CT機(德國Bruker公司)，Zwick IZ010型萬能材料測試機(德國Zwick/Roell公司)。

3 PRP的制備 采用含 0.8 ml 10% 枸椽酸鈉的注射器，于每只兔耳中央動脈抽取 5 ml 動脈血。采用 Landesberg 法[5]制備 PRP ：兩次離心轉數均為1100轉/min、離心半徑為15cm，時間均為8min，全血分為3層，取上清、交界層及交界層下少量紅細胞行二次離心，吸除上層貧血小板血漿，剩余1 ml即為富血小板血漿，加入微量(0.1 ml)激活劑氯化鈣。

4 實驗分組及方法 將 72 只大白兔隨機分成四組(n=18)，分別為富血小板血漿聯合骨碎補組，富血小板血漿組，骨碎補組，空白組，每組隨機取一側下肢行自體單股半腱肌腱移植重建ACL。手術前禁飲食 12 h，術前術區備皮、稱重，以 2.5%戊巴比妥鈉(40mg/kg)靜脈麻醉；0.5%碘伏消毒術野、鋪巾。沿膝關節髕骨旁內側緣作一長約3 cm的縱行切口，依次切開皮膚，皮下組織，剝離半腱肌腱，在肌腱、肌肉結合處斷開，用4-0強生縫合線編制縫合。繼續分離關節囊，直至暴露前交叉韌帶，用眼科剪在韌帶的股骨及脛骨附著點切斷(圖1、2)。用直徑2 mm鉆頭制備脛骨及股骨隧道，將單股肌腱拉入骨隧道中，將絲線收緊打結，并將肌腱縫合于隧道外口周圍軟組織上，行懸吊固定，實驗組及富血小板血漿組脛骨、股骨骨隧道中分別注入PRP 0.5 ml，最后逐層縫合傷口。放回原籠中飼養，自由活動。術后3 d內常規肌注青霉素40萬U/d 預防感染。

5 實驗干預 實驗組術后在骨隧道內注入 1 ml RPP，同時于造模后第2天開始按骨碎補1 g/ml 劑量灌胃[6]，每只兔子使用4 ml制備藥液，生理鹽水稀釋成10 ml 后灌胃給藥，連續21 d。富血小板血漿組在骨隧道中注入1 ml RPP，骨碎補組于造模后第2天開始按骨碎補1.5 g/(kg·d)劑量灌胃，每只兔子使用4 ml制備藥液，生理鹽水稀釋成10 ml 后灌胃給藥，連續21 d。空白組則在術后不作任何特殊處理。

6 動物處死及取材

6.1 動物處死：分別在術后4、8、12周，每組隨機以耳緣靜脈空氣栓塞法(20 ml空氣)各處死6只兔子。

6.2 取材:外科操作完整取下手術側脛骨和股骨，剔除周圍皮膚肌肉和軟組織，保留關節內外移植物，取下股骨-韌帶-脛骨復合體。

7 實驗觀察 兩組均隨機取一半標本用生理鹽水紗布包裹保存于-80℃冰箱，擇期行生物力學測定。其余標本置入4 %的多聚甲酪溶液中固定，行Micro-CT掃描。

7.1 生物力學測定[7]：①檢測前1 d將標本從-80℃冰箱，放于4℃冰箱過夜。②小心剔除膝關節中除重建的前交叉韌帶之外的所有肌肉、軟組織、韌帶和縫線，避免影響生物力學檢測。③恒溫下(25℃，濕度65%)，用Zwick IZ010型萬能材料測試機行生物力學檢測，設置拉伸速度為5mm/min，量程100N。④將股骨-韌帶-脛骨復合體置于生物力學測試儀中進行最大載荷拉伸試驗，詳細觀察并記錄將重建的前交叉韌帶帶從股骨或脛骨的骨隧道中拉出或將韌帶帶拉斷的最大加載負荷，并計算其剛度。

7.2 Micro-CT掃描：兩組取另一半標本，使用 Micro-CT(Sky Scan 1076，USA)進行掃描，掃描厚度為20μm，X線電壓 80 kV，電流 312 μA 。所有標本均行三維CT重建，獲取圖像后用Data Viewer 與CT vox軟件進行圖像分析及重建，測量股骨骨隧道擴大寬度(即術后各時間點股骨骨隧道內口大小減去鉆頭直徑2mm)大小(圖3)。同時通過Micro-CT測定腱骨結合處骨組織的骨密度(BMD)(圖4)。

結 果

術后10 d時實驗組及骨碎補組分別有1個關節出現感染而致兔子死亡，去除死亡動物后予補充。

1 術后股骨骨隧道內口擴大寬度 在 ACL 重建術后4、8、12周各組比較可見：實驗組股骨骨隧道內口擴大寬度均小于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，差異具有統計學意義(P均<0.05)；富血小板血漿組、骨碎補均小于空白組，差異具有統計學意義(P均<0.05)；富血小板血漿組各時間點隧道內口擴大寬度雖小于骨碎補組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2 骨密度(BMD)測定 術后4、8、12周，實驗組腱骨結合處骨密度均較高于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，差異具有統計學意義(P均<0.05)；骨碎補組各時間點腱骨結合處骨密度高于富血小板血漿組和空白組，差異具有統計學意義(P均<0.05)；富血小板血漿組各時間點腱骨結合處骨密度高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 術后四組標本股骨骨隧道內口擴大寬度比較

組 別n4周骨隧道內口寬度8周骨隧道內口寬度12周骨隧道內口寬度實驗組30.470±0.017*△▲0.413±0.015*△▲0.353±0.025*△▲富血小板血漿組30.553±0.040▲0.523±0.049▲0.460±0.044▲骨碎補組30. 600±0.030▲0.583±0.021▲0.530±0.035▲空白組30.657±0.0150.677±0.0210.617±0.021

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05

表2 術后四組標本骨密度(BMD)比較

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05。

3 生物力學測定 術后4、8、12周，實驗組標本的最大加載負荷均高于富血小板血漿組、骨碎補組、空白組，除第4周加載負荷與富血小板血漿組相比，差異無統計學意義外，其余各組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。富血小板血漿組第4、8周加載負荷均高于骨碎補組，差異具有統計學意義(P<0.05)，第12周加載負荷小于骨碎補組，兩組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；富血小板血漿組各時間點加載負荷均大于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)；骨碎補組第8、12周加載負荷大于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)，第4周加載負荷雖高于空白組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組標本最大加載負荷比較

注:與富血小板血漿組比較，*P<0．05；與骨碎補組比較，△P<0．05；與空白組比較，▲P<0．05

討論

現代藥理學表明，骨碎補的主要要用成分為柚皮甙和總黃酮。柚皮甙有抗氧化作用，可促進成骨細胞，人骨髓間充質干細胞等成骨樣細胞的增殖和分化[8]。其機制被認為是柚皮甙可下調成骨細胞中的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶，從而增強和促進成骨細胞骨形態發生蛋白2表達[9]。同時總黃酮可降低血液黏度，改善血液循環，起活血化瘀的作用，從而加快骨形成。楊麗等[10]通過觀察骨碎補水提液對大鼠骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化能力及轉化生長因子β1 (Transforming growth factor-β1 ，TGF-β1 )、骨形態發生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的影響，結果得出，骨碎補可促進TGF-β1 和BMP-2 的表達，而TGF-β1 和BMP-2均有調控間充質細胞增殖和分化的功能，可在成骨及骨基質合成中起重要作用。楊淵等[11]經體外實驗也證明成骨細胞經柚皮甙誘導后，由于富含堿性磷酸酶，可合成I型膠原，形成鈣化結節，促進MSCs的增殖和分化，加快成骨。

PRP含有大量生長因子及蛋白質，具有促進組織愈合和組織再生的功能，現在臨床上已經廣泛應用于骨關節炎[12]、軟骨缺損、骨不連[13]、肱骨外上髁炎[14]、跟腱炎等各種疾病。因PRP含有大量的生長因子，可以誘導成骨且不引起自身的免疫反應，同時能促進肌肉組織和骨組織愈合及再生[15]。張健等[16]將兔子分為對照組和PRP組，將其前交叉韌帶切斷，同時取同側自體半腱肌重建 ACL，對照組在骨隧道填充200 μl FG，而PRP組則在骨隧道填充 2 ml APRP + 200 μl FG，于術后 4、8、12周取實驗標本，行HE 染色、VEGF 免疫組化。結果顯示，術后4周對照組HE染色可見腱-骨處形成瘢痕組織，而同期PRP組則見肉芽組織，局部可見類軟骨細胞；術后8周對照組可見腱-骨處形成相對成熟的瘢痕組織，同時出現密實的膠原纖維連接，同期PRP組已經出現成熟的軟骨細胞；術后12周對照組見腱-骨連接處出現纖維軟骨細胞，PRP組則見膠原纖維錨于骨質，同時可見較多的纖維軟骨細胞，而且形態上，PRP組已接近正常ACL解剖結構，由此可見，ACL重建術后，生長因子在韌帶的生長愈合過程中起重要作用。趙耀等[17]也發現，PRP復合小牛脫蛋白制成凝膠擁有良好的生物相容性，可誘導骨生長，促進ACL重建術后腱-骨的愈合。

由于內在壞境、營養、功能的特殊性，ACL的愈合能力非常有限。同時，ACL內含 Ⅰ 型膠原少，而 Ⅲ 型膠原含量較多，因此，其膠原交聯程度較其他韌帶高，當ACL在受到生長因子刺激后，細胞的前移，增殖，基質合成方面弱于其他韌帶。韌帶的愈合主要有膠原參與，而生長因子能提高膠原的表達及生成。本研究將中藥骨碎補與PRP結合起來，用于ACL斷裂的治療，PRP中富含的血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進移植物的血管再生，血小板類生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)可加速韌帶的成熟，增強其抗拉能力。同時PRP中富含的生長因子以及骨碎補中的柚皮甙均可提高Ⅰ型膠原的表達及合成，對韌帶的腱-骨愈合起積極作用。本實驗結果也顯示，骨碎補聯合PRP組的骨隧道愈合情況、及肌腱的生物力學以及骨密度測定等指標均較PRP組好。因而，在PRP廣泛運用于臨床的時代，將傳統中藥骨碎補與PRP結合，可起到加快ACL重建后腱骨愈合、加強重建肌腱的韌性等作用。

可見，骨碎補聯合PRP 可加促進兔腱骨愈合，加強重建肌腱的韌性。