短梗五加莖黃酮對2型糖尿病模型小鼠降糖作用初步研究*

華 瑩

珠海霍普金斯醫藥研究院股份有限公司(珠海 519000)

主題詞 五加 糖尿病，2型/藥物療法 生物黃酮類/藥物作用 糖尿病，實驗性 模型，動物 小鼠

短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)又稱五加參、無梗五加，系五加科五加屬落葉灌木或小喬木植物[1-2]。原產地主要是分布于我國的東北黑龍江密山市完達山支脈-青梅山、吉林省安圖市和撫松縣、遼寧省千山以及俄羅斯和朝鮮[1-2]。短梗五加中的主要活性成由黃酮類、皂苷、木脂素、揮發油、有機酸等組成[3]。2008年國家衛生部已經批準短梗五加為新能源食物，其莖既是傳統的食用珍品，更是具有降血糖、降血脂、強心、健胃利尿的藥用保健佳品[4-9]。

近年來，對于天然中藥植物中的成分研究成為了熱點，利用食補替代藥補成為了健康保健品產業的發展趨勢。本研究為了探討短梗五加莖黃酮(Flavonoid of acanthopanax sessiliflorus Seem，FASS)對2型糖尿病(Type-II Diabetes mellitus，IIDM)及其并發癥的治療作用，首先利用高糖高脂日糧結合注射一定劑量的鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型Balb/C小鼠，然后對模型小鼠進行不同劑量的FASS和二甲雙胍藥物作為陽性對照灌胃處理，從而研究FASS對2型糖尿病小鼠降糖效果，不僅為日后開發天然降糖藥物提供基礎數據支持，更可以為長白山地區短梗五加中其它藥用活性成分的利用提供技術參數。

材料與方法

1 材 料 本研究材料為2017年5月中旬采自吉林省安圖市林場(129.07 E；43.08N)的短梗五加莖，經鑒定為短梗五加(Acanthopanax sessiliflorus Seem)的莖。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，購于美國索萊寶公司；二甲雙胍緩釋片(Metformin hydrochloride sustained release tablets，MHSRT)，購于中美上海施貴寶制藥有限公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等檢查試劑盒，購于上海生物工程試劑有限公司；其他生化試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

170只健康Balb/C小鼠(雌雄各半)，體重(20.0 ± 1.0)g，購于吉林大學小動物中心。將Balb/C小鼠飼養于標準化動物實驗室內，室內通風條件良好，晝夜變化正常，相對濕度在50%～65%，室溫在19 ～ 23 ℃。在建立2型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)模型小鼠前適應性飼養7 d。常規日糧，購于吉林省長春市實驗動物飼料公司，其中蛋白質含量為20%、碳水化合物含量為55%、脂肪含量為8%和纖維素含量為10%。高糖高脂日糧，由本實驗篩選獲得，1000 kg的高糖高脂日糧的配方是由690 g/kg常規日糧，添加150 g/kg的蔗糖、150 g/kg的豬油和10 g/kg膽固醇組成。

2 實驗方法

2.1 短梗五加莖黃酮的提取：取短梗五加嫩莖烘干至恒重，研磨粉碎，過60目篩，精確稱量1.0 g，按照料液比1∶5浸泡在85%乙醇處理12～14 h，再在35℃條件下超聲波處理1 h，然后用索氏回流提取2次，每次3～5 h，收集合并提取液，旋轉蒸發濃縮至膏狀。加入500 ml的蒸餾水溶解濃縮物，再加入等量的石油醚萃取，共計萃取5次，最后收集水相層溶液并置于恒溫水浴上蒸至100 ml，利用凍干機冷凍干燥過夜，最后收獲得到短梗五加黃酮粗干燥粉末。

2.2 2型糖尿病小鼠模型(NIDDN)的構建：取170只健康Balb/C小鼠，嚴格標記并測定體質量，更換飼喂本實驗室篩選配置好的高糖高脂日糧24 d，然后用5.0 mg/ml STZ(現用現配)以20 mg/kg的注射劑量進行腹腔注射處理，記錄注射處理的時間，72 h后測定小鼠血糖值，當測定的小鼠血糖值大于12.0 mmol/L時，可判定該小鼠為2型糖尿病小鼠模型(NIDDN模型小鼠)。同時，記錄模型小鼠的生理狀態，這時的模型小鼠與普通小鼠相比具有多食、多飲、多尿等常規生理狀態的變化出現。

2.3 實驗分組：隨機取NIDDN模型小鼠50只，分成5個小組(每組10只)，將其分成：模型空白對照組(DC組)、FASS劑量組(FASSL組)、FASS高劑量組(FASSH組)、二甲雙胍緩釋片(M組)以及正常的健康普通的Balb/C小鼠作為空白對照組(NC組)。NC組和DC組每天灌胃500 μl dH2O，FASSL組每天灌胃100 mg/kg的短梗五加莖黃酮，FASSH組每天灌胃300 mg/kg的短梗五加莖黃酮，M組每天灌胃500 μl含有5 mg/kg的二甲雙胍緩釋片。按照《中藥藥理研究方法學》關于人與小鼠體表面積計算獲得飼喂量對5個實驗組連續灌胃24 d，整個實驗重復3次，共計150只小鼠。

2.4 小鼠生理生化指標的檢測：五組小鼠分別在未灌胃、灌胃6 d、灌胃12 d、灌胃18 d和灌胃24 d，5個階段進行空腹尾部靜脈采血，利用血糖儀測定血糖值，檢測3次血糖值并記錄。當第25天時，對五組小鼠進行體質量測定并記錄，然后進行活體眼眶取血，再進行頸部脫勁處死，按照各個生理生化指標試劑盒檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量，重復檢測3次并記錄。

2.5 短梗五加莖黃酮對小鼠相關基因表達的影響：提取小鼠肝臟的總RNA，并利用試劑盒合成小鼠肝臟cDNA，置于-20℃冰箱中保存備用。根據NCBI查詢2型糖尿病的候選基因：胰島素受體(Insulin receptor-related receptor，INSRR)、肝細胞核因子(Hepatocyte nuclear factor-1-alpha，HNF1A)和葡萄糖轉運子10(Glucose transporter 2，GLUT10)的序列，設計熒光定量PCR引物，見表1。再利用熒光定量PCR檢測這3個基因在小鼠肝臟中的表達量，實驗重復3次。最后利用SDS 2.3軟件對測定的結果進行數據分析，并計算2-ΔΔCT，獲得3個基因的表達情況。

3 統計學方法 運用SPSS 23.0統計學軟件，計量方法以“平均值±標準差”的形式表示，采用t檢驗，多組間的差異分別采用的是ANOVA單因素方差分析。當P<0.05時具有統計學差異。

表1 小鼠中2型糖尿病的候選基因的實時熒光定量PCR引物

結 果

1 灌胃前后小鼠生理狀態的觀察與體質量的測定 對灌胃前后五組小鼠進行生理狀態觀察，在連續灌胃24 d后，NC組小鼠生理狀態良好，表現為小鼠的飲食和飲水量正常，反應靈敏。DC組小鼠生理狀態出現了明顯變化，主要表現為小鼠的飲食和飲水量相對增大，其排尿量也出現增多并出現腹瀉糞便稀的狀態，精神萎靡，反應遲鈍。FASSL組、FASSH組以及M組小鼠生理狀態也出現了與DC組小鼠類似的變化，但是表現程度相比DC組輕一些。

由圖1可知，短梗五加莖黃酮對五組小鼠體質量的影響。當建模前時，五組小鼠的體質量之間不存在差異(P>0.05)；當建模后灌胃前時，DC組、FASSL組、FASSH組和M組這四組小鼠與NC組相比，小鼠的體質量之間均存在顯著增加差異(P<0.05)；當建模后灌胃后時，FASSL組、FASSH組和M組這三組小鼠與DC組相比，小鼠的體質量之間均存在顯著降低差異(P<0.05)。因此，從上述結果可以確定：短梗五加莖黃酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的體質量的增長。

A：表示各組與正常對照組(NC組)相比，體質量存在統計學差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對照組(DC組)相比，體質量存在統計學差異(P<0.05)

圖1 短梗五加莖黃酮對五組小鼠體質量的影響

2 短梗五加黃酮對2型糖尿病模型小鼠血糖的影響 見表2。由表2可知，五組小鼠在未灌胃時，除正常對照組(NC組)以外，其他四組小鼠的血糖值不存在統計學差異(P>0.05)；在灌胃6 d時，FASSH組和M組的小鼠血糖值與DC組相比，存在明顯降低，有統計學差異(P<0.05)；在灌胃12 d時，FASSL組、FASSH組和M組的小鼠血糖值與DC組相比，存在明顯降低，有統計學差異(P<0.05)；在灌胃18 d時，FASSL組、FASSH組和M組的小鼠血糖值變化與灌胃14 d時變化趨勢相同；在灌胃24 d時，FASSH組和M組與正常空白對照組(NC組)的小鼠血糖值相比，不存在統計學差異(P>0.05)。因此，通過小鼠灌胃實驗可以說明，短梗五加莖黃酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血糖，從而改善小鼠高血糖病癥。

3 短梗五加黃酮對2型糖尿病模型小鼠血脂的影響 由圖2可知，隨著灌胃到達24 d，FASSL組中TC和TG含量水平、FASSH組中TC和TG含量水平以及M組中TC、TG和LDL-C含量水平，與NC組小鼠的三個指標的含量水平相比，均存在著上升趨勢，有統計學差異(P<0.05)；FASSL組、FASSH組以及M組中TC、TG和LDL-C含量水平，與DC組小鼠的三種指標的含量水平相比，均存在著降低趨勢，有統計學差異(P<0.05)。因此，通過小鼠灌胃實驗可以說明，短梗五加莖黃酮可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠血脂，從而調節小鼠血脂代謝紊亂狀態。

A：表示各組與正常對照組(NC組)相比，血脂含量存在統計學差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對照組(DC組)相比，血脂含量存在統計學差異(P<0.05)

圖2 短梗五加莖黃酮對五組小鼠血脂的影響

4 短梗五加莖黃酮對小鼠相關基因表達的影響 由圖3可知，熒光定量PCR數據表明：在FASSL組、FASSH組和M組中影響2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達與兩個對照組相比都存在著顯著提高，從而可以在基因表達層面上解釋，短梗五加莖黃酮對小鼠灌胃處理后，可以顯著促進糖尿病相關基因的表達，通過提高相關基因的表達使得小鼠血糖濃度降低，因此短梗五加莖黃酮可以調控2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達，來調節血糖濃度。

表2 短梗五加莖黃酮對五組小鼠血糖的影響(mmol/L)

注：各組與正常對照組(NC組)相比，*P<0.05；各組與模型對照組(DC組)相比，#P<0.05

A：表示各組與正常對照組(NC組)相比，基因表達量存在統計學差異(P<0.05)；B：表示各組與模型對照組(DC組)相比，基因表達量存在統計學差異(P<0.05)

圖3 短梗五加莖黃酮對小鼠相關基因表達的影響

討論

短梗五加與人參均為五加科植物，已經引起國內外的廣泛關注， 天然的食藥性中藥植物已經成為目前世界研究的活性成分分析的熱潮。雖然國內外學者在五加屬植物的生物學、化學、藥理學、基因組學等方面研究取得了一定的成果[12]，這不僅為短梗五加莖開發利用及食藥性保健品的研發奠定了基礎，更為中藥現代化產業化打下了堅實數據基礎。

2型糖尿病的發病機理主要是為胰島素抵抗(IR)和胰島素分泌缺陷而非胰島B細胞自身免疫破壞，而高血糖是2型糖尿病的主要病癥之一[10-11]。控制體內高血糖是減少和控制2型糖尿病以及其并發癥的主要辦法之一[12-13]。本研究結果發現，短梗五加莖黃酮能夠有效的降低2型糖尿病模型小鼠的病癥，短梗五加莖黃酮高劑量組(FASSH組)具有較好的降低血糖的療效，其效果與二甲雙胍緩釋片的效果相接近。已經有研究表明黃酮類化合物可以促進肝臟中外源葡萄糖的利用，從而具有降低血糖的作用，而本實驗可以推斷短梗五加莖黃酮能夠有效的降低血糖水平，可能是通過促進利用外源葡萄糖的雙向調節利用，或者是短梗五加莖黃酮可以從某種程度刺激胰島素分泌降低血糖。同時，我們利用了熒光定量PCR實驗，驗證了短梗五加莖黃酮，可以促進2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的表達，從而從基因表達調控角度研究短梗五加莖黃酮調控血糖的機制，但是本研究還處于初步研究，有待于日后進一步深入的研究。

短梗五加莖黃酮可以控制2型糖尿病(NIDDM)模型小鼠的體質量的增長，也可以有效的降低2型糖尿病模型小鼠的血糖和血脂，同時還可以調控小鼠中相關2型糖尿病的INSRR、HNF1A和GLUT10基因的上調表達，從而調節血糖濃度，這不僅改善高血糖病癥和緩解血脂代謝紊亂的問題提供了研究基礎，更為日后醫藥研究提供了基礎數據。