FK866對脂多糖誘導大鼠急性肺損傷的影響*

李清梅，袁名權，陳 虎，羅 榮，段顯榮，秦榜勇（遵義醫學院麻醉醫學院，貴州遵義563003）

肺內炎性細胞和細胞因子介導的肺泡毛細血管膜損傷可導致肺水腫的發生，進一步發展可引起急性肺損傷（ALI），其中多形核中性粒細胞（PMN）在肺內的聚集和激活是脂多糖（LPS）所致ALI最常見的病理學改變和導致肺損傷的機制[1]。

FK866（又名 APO866或 WK175）是 2003年由HASMANN等[2]采用美國國家癌癥研究所建立的篩選方法發現的前B細胞集落增強因子（PBEF）抑制劑，能特異性非競爭性抑制PBEF。PBEF通過介導炎性細胞因子產生，抑制PMN凋亡，調控肺血管內皮細胞和上皮細胞的通透性，在ALI中起十分重要的作用[3]。MATSUDA等[4]研究數據提示，PBEF可能是炎性通路中的信號傳遞者，其作為炎性細胞因子，通過激發其他炎性細胞因子的表達，在ALI的發病機制中起重要作用。而PBEF的特異性非競爭性抑制劑FK866能否通過對PBEF的抑制作用，減輕肺內炎性細胞因子的表達和釋放，對ALI產生保護作用，還有待進一步驗證。本研究擬通過LPS誘導大鼠ALI模型，觀察給予FK866干預后對大鼠ALI的影響，從而探討PBEF在ALI中的相關作用機制，同時為ALI的治療提供新的思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級健康雄性SD大鼠，平均體重（250±30）g。由中國人民解放軍陸軍軍醫大學大坪醫院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012-0005。

1.1.2 主要實驗試劑 LPS（E.Coli 055：B5）Sigma-L2880，FK866，二甲基亞砜（DMSO），戊巴比妥鈉。

1.1.3 藥物配制 （1）LPS：每支 10 mg，加生理鹽水（NS）溶解至20 mL，旋渦振蕩器混勻，藥物水平為0.5 mg/mL，4 ℃冰箱保存，一周內用完。（2）FK866：每支5 mg，加DMSO溶解至5 mL，旋渦振蕩器混勻，藥物水平為1 mg/mL，4℃冰箱保存，24 h內用完。

1.2 方法 將健康雄性SD大鼠50只隨機分為5組，每組10只，分別為NS對照組NS+NS（A組）、單純給藥組 NS+FK866（B 組）、ALI模型組 LPS+NS（C 組）、藥物干預組LPS+FK866（D組）及溶媒對照組LPS+DMSO（E組）。經尾靜脈注射LPS 5 mg/kg成功制作大鼠內毒素ALI模型。給藥6 h后，5組動物均腹腔內注射2.5%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉生效后，開胸取左上肺葉；一部分肺組織10%甲醛液中固定肺組織，脫水、石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（HE）染色光鏡下觀察其病理變化；另一部分肺組織勻漿后采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統計學處理，計量資料以表示，進行ONE-WAY ANOVA處理，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Dunnett′T3法進行組間比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大體行為變化 A組大鼠自由活動、攝食、飲水、口唇顏色、毛發、呼吸頻率等無改變。B組大鼠大體行為變化與A組相似。C組大鼠呼吸急促，口唇發紺，眼半閉，精神萎靡，活動力差，毛發糙亂，刺激不活動，未見攝食、飲水，鼻腔內偶見粉紅色泡沫痰，聽診肺部聞及大面積啰音，偶見血性尿。D組大鼠呼吸稍促，精神萎靡，刺激可見有少許活動，偶而可見飲水，聽診肺部可聞及啰音。E組大鼠大體行為變化與C組相似。

2.2 肺組織病理形態變化 A、B組大鼠肺組織的結構清晰完整，肺泡壁光滑、肺泡腔及間質基本無液體及紅細胞滲出，肺泡間質無增寬及炎性細胞浸潤，見圖1、2。C、E組大鼠肺組織結構紊亂，肺間質明顯增寬，肺間質可見大量炎性細胞及紅細胞滲出，肺泡腔見大量滲出液，大量肺泡腔塌陷及肺泡壁斷裂，見圖3、4。D組大鼠肺組織肺間質增寬，大量炎性細胞浸潤及紅細胞滲出，肺泡腔見大量滲出液，部分肺泡壁斷裂，局部肺泡腔塌陷，但較C、E組有所減輕，見圖5。

2.3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-β蛋白水平比較 與A、B組比較，其余各組TNF-α及IL-1β水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與 D 組比較，C、E組TNF-α及IL-1β水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。A組TNF-α及IL-1β水平與B組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。C組 TNF-α 及 IL-1β 水平與E組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 A組肺組織HE染色（200×）

圖2 B組肺組織HE染色（200×）

圖3 C組肺組織HE染色（200×）

圖4 E組肺組織HE染色（200×）

圖5 D組肺組織HE染色（200×）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α及IL-1β蛋白水平比較（±s，ng/L）

表1 各組大鼠肺組織TNF-α及IL-1β蛋白水平比較（±s，ng/L）

注：與 A、B 組比較，aP＜0.05；與 C、E 組比較，bP＜0.05；與 D 組比較，cP＜0.05

組別A組B組C組D組E組n 10 10 10 10 10 TNF-α 148.70±14.75bc 141.87±10.81bc 243.80±9.59ac 214.80±8.23ab 247.69±12.28ac IL-β 19.77±2.67bc 19.95±3.08bc 33.80±3.32ac 26.90±2.65ab 35.16±3.68ac

3 討 論

臨床上，嚴重感染、創傷、休克等多種情況均可能導致失控性全身炎癥反應綜合征（SIRS），誘發ALI。其中，嚴重內毒素膿毒癥所致ALI的發生較為常見。有研究顯示，LPS作為重要的促炎因子，可通過上皮細胞TOLL樣受體 4（TLR-4）激活NF-κB通路參與炎性反應[5]。本實驗經尾靜脈注射LPS成功制作大鼠ALI模型。近期研究發現，PBEF作為一種新的炎性細胞因子與ALI病理生理密切相關。PBEF能促進肺泡上皮損傷，增加肺泡通透性[6]。而FK866作為PBEF的特異性抑制劑[4]，能通過非競爭性結合PBEF，抑制其酶活性，發揮抗炎性反應作用。參考文獻[7]報道，FK866的用藥劑量為10 mg/kg，根據LPS和FK866的用藥劑量，可換算出每只老鼠注射2種藥的容量均為10 mL/kg。

TNF-α是ALI炎性失控機制中的關鍵細胞因子，被認為是全身性炎癥反應的始動介質，也是導致ALI加重的重要因子。其中，TNF-α是啟動急性炎性反應的主要細胞因子。有文獻報道，TNF-α會產生過多可破壞溶酶體，從而導致肺血管內皮細胞和上皮細胞損傷[8]。有研究觀察到炎性細胞因子TNF-α等能夠促進PBEF的表達[9]。有研究發現，LPS可誘導小鼠肺組織中IL-6和 TNF-α 水平增多[10]。VAN-GOOL 等[11]研究表明，在許多炎性疾病中，TNF合成受到PBEF影響，PBEF通過Sirtuin家族Sirt6途徑在轉錄后水平提高，增加了TNF的合成產量。ESPOSITO等[12]的實驗結果表明，腹腔注射FK866可減輕壓縮性脊髓損傷小鼠模型的脊髓炎性反應和損傷程度，糾正損傷部位PBEF的高表達水平，降低病灶周圍TNF-α、IL-1β水平，維護損傷部位脊髓正常的灰質/白質結構和神經元功能。本實驗結果表明，LPS誘導大鼠ALI后，TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），與上述研究報道結果相符。應用PBEF特異性抑制劑FK866腹腔注射干預后，肺組織TNF-α水平明顯降低，推測FK866可能通過下調PBEF的基因轉錄，減低PBEF蛋白表達，從而抑制TNF-α的釋放，對ALI產生了保護作用。

IL-1β是具有觸發進一步炎性反應的促炎性細胞因子，可以刺激炎性細胞趨化因子的產生，因此被稱之為“早期反應細胞因子”[13]。在急性呼吸窘迫綜合征發生、發展中，出現明顯的炎性反應瀑布樣級聯反應，其早期外周血、肺及其他組織中的炎性細胞快速釋放TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子，形成第1次級聯釋放，釋放出的細胞因子作用于肺組織中的肺泡上皮細胞、血管內皮細胞等激發趨化因子等引起第2次級聯釋放[14]。研究發現，在LPS誘導的肺泡上皮細胞炎性模型中，PBEF升高伴隨著NF-κB的激活，繼而促進炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8表達和釋放。而在使用PBEF抑制劑FK866后，NF-κB活性降低，炎性細胞因子表達下降[15]。本實驗結果表明，LPS誘導大鼠ALI后，肺組織IL-1β的水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），與上述研究報道結果相符。應用PBEF特異性抑制劑FK866腹腔注射干預后，肺組織IL-1β水平明顯降低，推測FK866可能通過下調PBEF的基因轉錄，減低PBEF的蛋白表達，從而抑制了促炎性細胞因子IL-1β的釋放，對ALI產生了保護作用。

綜上所述，FK866作為一種PBEF的特異性非競爭性抑制劑，可通過抑制肺組織促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的表達和釋放，一定程度上減輕LPS誘導的ALI大鼠肺組織病理損傷程度，對內毒素ALI大鼠肺組織具有一定的保護作用。因此，其在臨床膿毒癥致ALI的藥物治療中具有潛在的研究價值。