P16INK4A蛋白與HPV L1殼蛋白在診斷子宮頸病變中的應(yīng)用

王勉勉，嚴(yán)育宏，張愛慕，蔣義

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）是與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的一組癌前病變[1]。對(duì)子宮頸癌前病變?nèi)巳哼M(jìn)行病變等級(jí)的判斷及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后，指導(dǎo)臨床醫(yī)生管理與治療，將是一個(gè)重大的課題。有研究顯示，從人乳頭瘤病毒（HPV）感染到最終發(fā)展為宮頸癌的較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)，腫瘤抑制基因P16INK4A蛋白及HPV感染細(xì)胞的靶位點(diǎn)人乳頭瘤病毒L1殼蛋白（HP VL1），兩者的表達(dá)與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[2]。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)P16INK4A蛋白及HPVL1在宮頸不同病變組織中的表達(dá)情況，分析二者的相關(guān)性，探討這兩項(xiàng)檢測(cè)作為子宮頸病變?cè)缙谠\斷及進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1―12月

在浙江省溫州市中心醫(yī)院就診，行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）排除正常或炎癥者，且HPV基因檢測(cè)示高危型HPV陽性患者140例，年齡21～70歲，平均（39±9）歲。剔除近期妊娠、有免疫系統(tǒng)抑制性疾病者。所有患者行P16INK4A蛋白與HPV L1殼蛋白檢查及陰道鏡下宮頸活檢。采用組織學(xué)病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.2 方法

1.2.1 宮頸細(xì)胞學(xué)檢查 采用美國(guó)新柏氏液2000全自動(dòng)制片機(jī)將標(biāo)本進(jìn)行程序化處理制片，由兩位病理科醫(yī)師閱片。結(jié)果判斷按照 TBS分類：正常或炎癥（NILM）、不明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）、非典型鱗狀細(xì)胞-不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變（ASC-H）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）及鱗狀上皮浸潤(rùn)癌（SCC）。

1.2.2 HPV DNA分型檢測(cè) 采用凱普公司提供的試劑盒，使用PCR-反向雜交基因芯片技術(shù)，檢測(cè)21種HPV亞型的基因分型，其中13種 HPV高危亞型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 及 68）。

1.2.3 P16INK4A 蛋白檢測(cè) 采用SABC法免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作。以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核黃色或棕黃色染色為陽性，表達(dá)強(qiáng)度參照Kleas等[3]的半定量標(biāo)準(zhǔn)，觀察10個(gè)代表性視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。陰性：陽性細(xì)胞百分率＜10%或染色強(qiáng)度與背景顏色無明顯差異；弱陽性（+）：陽性細(xì)胞百分率10%～30%，染色強(qiáng)度較弱；中度陽性（2+）：陽性細(xì)胞百分率31%～60%；強(qiáng)陽性（3+）：陽性細(xì)胞百分率＞60%。

1.2.4 HPV L1殼蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)方法和分子雜交技術(shù)雙重檢測(cè)，將液基薄層細(xì)胞標(biāo)本再次制片，按照“CytoReact賽泰”細(xì)胞/組織HPV-L1殼蛋白染色試劑盒（美國(guó)愛迪旺斯公司產(chǎn)）說明書進(jìn)行操作。HPV L1殼蛋白陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：≥1個(gè)細(xì)胞染色陽性。

1.2.5 陰道鏡下宮頸活檢和組織病理檢查 通過陰道鏡觀察和判斷，對(duì)醋酸白斑區(qū)、碘試驗(yàn)不染色區(qū)、異常血管區(qū)等宮頸部位采集標(biāo)本，并用4%的甲醛溶液進(jìn)行固定，進(jìn)行病理檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用 2檢驗(yàn)或者 Fisher確切概率檢驗(yàn)法。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)診斷結(jié)果 組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《WHO分類女性生殖器官腫瘤》（第4版）[4]，診斷結(jié)果包括慢性炎癥、LSIL（相當(dāng)于 CINI）、HSIL（相當(dāng)于 CIN II～I(xiàn)II）及子宮頸癌（SCC）。細(xì)胞學(xué)結(jié)果及組織學(xué)結(jié)果見表1。

2.2 P16INK4A在不同宮頸組織中的表達(dá) 從宮頸慢性炎癥、LSIL、HSIL到宮頸癌，P16INK4A的陽性率呈逐漸增高，宮頸慢性炎癥組織和 LSIL組織中P16INK4A陽性表達(dá)率，以及LSIL組織和HSIL組織中P16INK4A陽性表達(dá)率差異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 2=9.588、25.187，均＜0.05），而HSIL組織和宮頸癌組織中P16INK4A陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。LISL組、HSIL組及宮頸癌組的P16INK4A陽性率與慢性宮頸炎組織差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。慢性炎癥癥組+LSIL組和HSIL組+宮頸癌組宮頸組織的P16INK4A陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 2=61.405，P＜0.05）。見表2。

2.3 HPVL1殼蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá) 從宮頸慢性炎癥、LSIL、HSIL到宮頸癌，HPVL1殼蛋白的陽性率呈逐漸降低，宮頸慢性炎癥組織、LSIL組織中HPVL1殼蛋白的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 2=0.148，P＞ 0.05），HSIL組織和宮頸癌組織中HPVL1殼蛋白的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；LSIL組織和HSIL組織中HPVL1殼蛋白的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 2=21.059，P＜0.05）。以慢性宮頸炎組的HPVL1殼蛋白的陽性率作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，HSIL組及宮頸癌組的HPVL1殼蛋白的陽性率與慢性宮頸炎組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。慢性炎癥組合并LSIL組，HSIL組合并宮頸癌組，兩組宮頸組織的HPVL1殼蛋白的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

2.4 P16INK4A與HPVL1殼蛋白聯(lián)合表達(dá)情況 選擇P16INK4A－或HPVL1+，和P16INK4A+或HPVL1－進(jìn)行分組，其在不同宮頸中的分布見表4。以組織病理學(xué)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，單獨(dú)宮頸TCT預(yù)測(cè)高危型 HPV陽性患者≥HSIL的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為42.86%、93.41%、77.78%、75.22%，P16INK4A及HPVL1殼蛋白聯(lián)合的預(yù)測(cè)高危型HPV陽性患者≥HSIL的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為91.48%、92.31%、86.54%、95.45%。見表5。

3 討論

表1 140例宮頸細(xì)胞組織學(xué)診斷結(jié)果與細(xì)胞學(xué)診斷的對(duì)照 例

TCT是目前宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的主要手段，但其準(zhǔn)確性受取材、標(biāo)本制作的影響，不可避免的存在一定的漏診率[5]。尤其是細(xì)胞學(xué)TBS診斷標(biāo)準(zhǔn)中的ASCUS，可能為炎癥，亦可能為宮頸上皮內(nèi)瘤變。本文TCT且HPV陽性共140例，TCT的靈敏度僅42.86%，但TCT的特異度有93.41%，此結(jié)果可能與本實(shí)驗(yàn)采用門診普查人群有關(guān)。提示在對(duì)≤LSIL的判斷中，TCT存在較大的缺陷，而在對(duì)≥HSIL的判斷中仍是準(zhǔn)確率非常高的。故在診治與隨訪過程中選擇更可靠的生物學(xué)指標(biāo)，并彌補(bǔ)TCT在對(duì)正常和低度上皮內(nèi)瘤變上的判斷缺陷將有重要的意義。

3.1 P16INK4A蛋白的表達(dá)與子宮頸病變的關(guān)系 在許多惡性腫瘤中P16INK4A基因表達(dá)缺失，但國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌P16INK4A的研究結(jié)果多報(bào)道為過表達(dá)[6]。還有研究指出 P16INK4A在HSIL及以上病變中顯著高表達(dá)，具有高度敏感性，可作為HSIL及以上病變?cè)\斷、鑒別診斷的敏感指標(biāo)[7-8]。王榮敏等[9]在對(duì)CINⅠ患者隨訪中得出，P16INK4A陽性表達(dá)者病變進(jìn)展率是陰性表達(dá)者的3.87倍；故可將P16INK4A作為宮頸上皮內(nèi)瘤變低、高分級(jí)的可靠指標(biāo)，并預(yù)測(cè)CIN的轉(zhuǎn)歸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能因本研究宮頸癌病例偏少而造成的偏差。

3.2 HPVL1蛋白的表達(dá)與子宮頸病變的關(guān)系 HPVL1殼蛋白陰性可能提示HPV處于結(jié)合狀態(tài)且細(xì)胞免疫應(yīng)答降低，發(fā)生CIN或?qū)m頸癌的概率較高[10]。Mehlhorn等[11]在一項(xiàng)前瞻性國(guó)際多中心研究中發(fā)現(xiàn)，無論在 LSIL還是在HSIL中，L1表達(dá)陽性患者的臨床轉(zhuǎn)歸與L1表達(dá)陰性患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽性患者病變消退的概率為陰性患者的5.4倍（63% 12%），陰性患者病變進(jìn)展為HSIL或癌的概率是陽性患者的3.8倍（59% 16%）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)可以將HPVL1殼蛋白作為預(yù)測(cè)區(qū)分宮頸病變低度和高度的有效指標(biāo)。

3.3 P16INK4A蛋白與HPVL1蛋白聯(lián)合在子宮頸病變中意義 有研究表明P16INK4A和HPVL1衣殼蛋白免疫染色聯(lián)合結(jié)果是非常有用的預(yù)后指標(biāo)[2，12]。筆者基于 P16INK4A-HPVL1組合歸納為4個(gè)不同的類別。（1）P16INK4A+/HPVL1－：HPV DNA與宿主細(xì)胞基因組整合使細(xì)胞周期改變，從而抑制了RB蛋白通路，使其沒有生殖性和生命力。它可能被定義為高風(fēng)險(xiǎn)的模式，通常在宮頸高級(jí)別病變里發(fā)現(xiàn)。本文 3例（100%）的宮頸癌，29例（63.04%）的高級(jí)別病變和7例（17.07%）的低級(jí)別病變表 達(dá) 這 種 模 式。（2）P16INK4A+/HPVL1+：這種模式雖然RB蛋白通路已經(jīng)存在抑制（P16INK4A+），但L1蛋白仍然有效，表明病變?cè)诓《井a(chǎn)生階段，有立即發(fā)生進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。本文8例（19.51%）低級(jí)別病變和9例（19.56%）高級(jí)別病變組織表達(dá)這種模式，但無宮頸炎組織表達(dá)這種模式。（3）P16INK4A－/HPVL1－：這種模式既沒有抑制 RB蛋白通路（P16INK4A－），又沒有有效的L1蛋白產(chǎn)生。P16INK4A的丟失是因?yàn)橥蛔兓蚣谆@可能就是P16INK4A陰性腫瘤的假設(shè)原因。本文9例（18.00%）宮頸炎，6例（14.63%）低級(jí)別病變，4例（8.70%）高級(jí)別病變表達(dá)這種模式。（4）P16INK4A－/HPVL1+：此時(shí)RB蛋白通路處于工作狀態(tài)且L1蛋白有效，意味著病毒DNA雖存在但不改變細(xì)胞周期，發(fā)展成高級(jí)別CIN的風(fēng)險(xiǎn)低。本文37例（74.00%）宮頸炎，20例（48.78%）低級(jí)別病變，4例（8.70%）高級(jí)別病變顯示這種模式。

P16INK4A蛋白和HPVL1殼蛋白的聯(lián)合表達(dá)在宮頸病變中隨著病理級(jí)別增高而增加的趨勢(shì)為P16INK4A－/HPVL1+、P16INK4A－/HPVL1－、P16INK4A+/HPVL1+、和 P16INK4A+/HPVL1－。低級(jí)別病變往往與HPV病毒短暫性感染有關(guān)，會(huì)自發(fā)的消退而不需要治療。在這些情況下，P16INK4A/L1表達(dá)狀態(tài)可能有助于識(shí)別處于危險(xiǎn)中的個(gè)體。臨床上P16INK4A+/HPVL1－和 P16INK4A+/HPVL1+的個(gè)體需要嚴(yán)格的后續(xù)行動(dòng)，P16INK4A－/HPVL1－的個(gè)體歸類為低風(fēng)險(xiǎn)，低級(jí)別病變?yōu)榇四Ｊ秸咝瓒虝r(shí)間內(nèi)進(jìn)行跟蹤，P16INK4A－/HPVL1+的個(gè)體被視為沒有明顯發(fā)育不良的模式。筆者發(fā)現(xiàn)P16INK4A及HPVL1在靈敏度方面較TCT檢查有明顯優(yōu)勢(shì)，但特異度和陽性預(yù)測(cè)值較TCT欠缺；P16INK4A聯(lián)合HPVL1殼蛋白后，4個(gè)指標(biāo)均較單獨(dú)TCT檢查有優(yōu)勢(shì)。TCT在特異度方面已較精準(zhǔn)，而P16INK4A聯(lián)合HPVL1可以在靈敏度上對(duì) TCT有一個(gè)明顯的提高。

表2 P16INK4A在正常和異常宮頸組織中的表達(dá)情況 例

表3 HPVL1殼蛋白在正常和異常宮頸組織中的表達(dá)情況 例

表4 P16INK4A和HPVL1殼蛋白聯(lián)合表達(dá)結(jié)果 例（%）

表5 各種檢測(cè)方法對(duì)宮頸病變檢測(cè)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值 %

綜上所述，P16INK4A蛋白和HPVL1殼蛋白均可作為宮頸癌癌前病變的可靠判斷指標(biāo)，兩者聯(lián)合檢測(cè)可補(bǔ)充 TCT檢測(cè)對(duì)低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的區(qū)分，可能有助于發(fā)現(xiàn)具有惡性潛能的CIN，可成為CIN的診斷、分級(jí)及判斷其轉(zhuǎn)歸的有效指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)還可進(jìn)一步完善除宮頸癌的各級(jí)別宮頸病變的轉(zhuǎn)歸，隨訪其1年、2年、5年的消退、維持和進(jìn)展情況。