百里醌對(duì)體內(nèi)外人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)和凋亡的影響

吳志豪，王文茜，馬瑞民，鄭敏

乳腺癌排名女性惡性腫瘤第一位。臨床上常用的外科手術(shù)、化療及放療等手段均有諸多問(wèn)題。因此尋求一種新的有效的抗癌藥物，從而改善患者預(yù)后顯得尤為迫切。黑種草籽油具有多種生物活性，在哮喘、痢疾、濕疹及高血壓等疾病的治療上有悠久的歷史[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)從黑種草籽油中分離出來(lái)的主要有效單體―百里醌可有效抑制胰腺癌[2]和前列腺癌[3]、大腸癌[4]等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，證實(shí)其具有強(qiáng)大的抑癌作用。但百里醌對(duì)三陰性乳腺癌的抑制作用卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究觀察了百里醌對(duì)體內(nèi)外人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7生長(zhǎng)和凋亡的影響，為臨床用藥提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料 百里醌（Sigma公司，美國(guó)）；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）。Ki-67、survivin抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；百里醌用無(wú)水乙醇配制成10 mmol/L，－20℃冰箱保存，用時(shí)用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡健康BALB/c雌性小鼠購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量18～20 g，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 SPF屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)（無(wú)特定病原體級(jí)），室溫控制在（25±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)在含l0%胎牛血清、濃度100 U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，至70%～80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞經(jīng)百里醌作用24 h后以0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔10l。分組培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10l CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑[5]，于37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm下讀取吸光度A值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A450值/對(duì)照組A450值）×100%

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將百里醌作用24 h后的細(xì)胞用胰酶消化，冷PBS洗滌2次后重懸并計(jì)數(shù)，1000 r/min離心5 min，用500l Binging Buffer重懸細(xì)胞，加入5l AnnexinV-FITC和5l PI，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)20min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.4 裸鼠乳腺癌皮下移植瘤的建立和給藥方案選擇4～6周齡雌性BALB/c裸鼠，將2×107個(gè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7懸浮于0.2 ml無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，注射到裸鼠背部靠近右側(cè)后肢皮下建立裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型。接種2周后，待移植瘤體積長(zhǎng)至100～150mm3，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，分別灌胃給予溶媒（1%乙醇）0.2 ml/只和百里醌3 mg/只，每周給藥3次，共2周。第8周處死動(dòng)物留取腫瘤組織，并測(cè)量腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（1－治療組平均重量／對(duì)照組平均重量）×100%。

1.3.5 TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核發(fā)生固縮、染色體凝集成塊或邊集、呈棕褐色染色，低倍鏡（×100）下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，圖片結(jié)果用Image-ProPlus6.0圖像處理軟件進(jìn)行檢測(cè)IOD值。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67和survivin表達(dá)每組各選取5個(gè)腫瘤組織，按照Envision法的操作步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，選取新鮮腫瘤組織經(jīng)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、一抗孵育和封片后。在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，計(jì)算鏡下染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用方差分析和 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度百里醌對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 百里醌對(duì)人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性。見(jiàn)表1。

2.2 百里醌對(duì)體外人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7凋亡的影響 百里醌（20、40和80mol/L）作用MCF-7細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為 21.5%、24.6%和28.9%。見(jiàn)封二彩圖1。

2.3 百里醌對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 對(duì)照組和百里醌組的鼠重均有不同程度的降低，實(shí)驗(yàn)組少量裸鼠治療期間出現(xiàn)腹瀉、稀便及脫水表現(xiàn)，但療程結(jié)束也隨之停止。第56天處死動(dòng)物后，對(duì)照組腫瘤平均重量為（0.88±0.23）g；百里醌組腫瘤平均重量為（0.29±0.12）g，抑瘤率為 64.8%。

2.4 百里醌對(duì)裸鼠乳腺腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為僅胞核染成棕褐色。與對(duì)照組相比較，百里醌組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于對(duì)照組。見(jiàn)封二彩圖2。

2.5 百里醌對(duì)裸鼠腫瘤組織細(xì)胞Ki-67和survivin陽(yáng)性表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤組織中大量細(xì)胞中細(xì)胞增殖因子Ki-67和survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)（封二彩圖3）；而百里醌組腫瘤組織中Ki-67和 survivin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著減少。各組腫瘤組織切片經(jīng)PBS代替特異性一抗作為空白對(duì)照，腫瘤組織鏡下均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。

3 討論

表1 不同濃度百里醌對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

目前針對(duì)乳腺癌的各種治療手段和抗癌藥物的應(yīng)用都具有一定的危險(xiǎn)性和毒副作用，因此尋求一種安全而毒副作用小的抗腫瘤藥物成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)大量研究表明提取自黑種草籽油的主要有效單體百里醌能有效抑制多種惡性腫瘤生長(zhǎng)，其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方式以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，且沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性[2-4]。本研究發(fā)現(xiàn)百里醌對(duì)體外人乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明確的增殖抑制作用，增殖抑制效果呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和劑量依賴性。Annexin V-FTIC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)百里醌能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞早期凋亡，表明百里醌抑制乳腺癌生長(zhǎng)方式可能也是以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式為主；同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也觀察到百里醌能有效抑制乳腺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿。另外，在本實(shí)驗(yàn)中裸鼠在百里醌給藥期間僅有輕微不良反應(yīng)，表明百里醌在對(duì)機(jī)體無(wú)明顯影響的前提下仍可顯著抑制乳腺癌生長(zhǎng)。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示百里醌還可同時(shí)抑制ki67和survivin的表達(dá)，表明調(diào)控survivin在百里醌抑制乳腺癌生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定的作用。但還需大量工作研究survivin在百里醌抑制乳腺癌MCF-7中的更多機(jī)制。