結核感染T細胞斑點試驗對使用免疫抑制劑患者 并發肺結核的診斷價值

譚毅剛 李嫣紅 鄭閩莉

由于器官移植、腫瘤、結締組織疾病等需接受免疫抑制藥物治療患者的免疫功能降低，導致免疫損害宿主(immunocompromised host，ICH)易并發結核感染。相關文獻報道，ICH并發肺結核患者的臨床表現及影像學特征與普通細菌感染相似，影像學分析及結核菌素純蛋白衍生物試驗(簡稱“PPD試驗”)對診斷結核病差異明顯，極易漏診和誤診[1-3]。近年來，以T細胞免疫為基礎的體外γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assays，IGRA)成為結核病免疫診斷技術的重要突破，其中結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)成為具有較好特異度和敏感度的重要檢測手段[4]。然而其在需要采用免疫抑制劑治療的患者并發結核病時的檢測效果少見報道，故筆者嘗試分析此類患者采用血T-SPOT.TB檢測對結核病的診斷價值。

對象和方法

一、研究對象的來源和分組

回顧性收集廣州市胸科醫院2013年7月至2015年12月收治的因基礎疾病使用免疫抑制劑(如糖皮質激素、細胞毒藥物等)治療6個月以上，且并發肺結核的初治患者197例(簡稱“觀察組”)；收集同期200例未使用免疫抑制劑的初治肺結核患者(簡稱“對照組”；與觀察組患者為相鄰住院號的患者，若相鄰住院號患者不符合入選標準，則順延住院號選擇患者)的臨床資料。所有患者外周血檢測的CD3+、CD4+T淋巴細胞絕對值計數均低于正常數值下限。

觀察組患者中，男107例(54.3%)，女90例(45.7%)；年齡15～84歲，平均年齡(43.0±15.2)歲；基礎疾病包括腎移植者44例、腎病綜合征41例、類風濕性關節炎40例、系統性紅斑狼瘡72例。對照組患者中，男126例(63.0%)，女74例(37.0%)；年齡18～81歲，平均年齡(45.5±17.6)歲。兩組患者均排除患有糖尿病、腫瘤、HIV感染等其他疾病，同時均排除確診為耐多藥結核病的患者。

二、肺結核診斷標準[5]

通過痰液或支氣管灌洗液(BALF)的涂片或培養查找抗酸桿菌，對陽性菌株行菌種鑒定以排除非結核分枝桿菌，結合胸部X線攝影檢查符合活動性肺結核表現；菌陰肺結核診斷標準見文獻[5]。

三、檢測方法

1．外周血T-SPOT.TB檢測方法及結果判定：選用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英國)試劑盒，從外周靜脈血中分離出單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個預包被抗γ干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMC，分別與兩種抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，使用酶聯免疫斑點(ELISPOT)讀板儀對斑點進行計數。

陽性判斷標準：(1)如果空白對照孔斑點數<6個，檢測孔斑點數減去空白對照孔斑點數>6；(2)如果空白對照孔斑點數≥6個，檢測孔斑點數必須>2倍的空白對照孔斑點數。反之，為陰性結果。陰性或陽性對照異常，試驗均視為無效。

2．抗酸桿菌金胺O熒光染色涂片鏡檢(簡稱“金胺O涂片鏡檢”)：用接種環挑取痰液或支氣管灌洗液中干酪樣膿樣或帶血小塊，制成厚涂片，自然干燥，染色前火焰固定。將制好的涂片用金胺O溶液染色，加溫促使菌體著色，3%鹽酸乙醇脫色，然后用高錳酸鉀溶液復染，置含有紫外光源的熒光顯微鏡下檢查，抗酸桿菌會發出閃亮的橘黃色，則為陽性。

3．結核分枝桿菌快速液體培養及菌種鑒定：結核分枝桿菌培養操作程序嚴格按照中國防癆協會基礎專業委員會編著的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]要求進行，采用BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)系統對結核分枝桿菌進行分離培養和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，以對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)鑒別培養基初步菌株鑒別結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非結核分枝桿菌。

4．PPD試驗：所有研究對象在采血后，使用Mantoux法在前臂皮內注射PPD 0.1 ml(5 IU)，72 h 檢測反應結果，用直尺量取硬結平均直徑并記錄。若硬結平均直徑≥5 mm為陽性，≥15 mm為強陽性，以紅腫硬結平均直徑≥15 mm作為判斷是否感染結核分枝桿菌的標準。

四、統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

觀察組臨床確診的197例患者中，外周血T-SPOT.TB檢測陽性為168例，陰性為29例，即陽性率和敏感度均為85.28%；分泌物金胺O涂片鏡檢找分枝桿菌陽性為72例，陰性為125例；分泌物分枝桿菌MGIT 960培養陽性106例，經菌種鑒定均為結核分枝桿菌；PPD試驗陽性者68例，陰性者129例。對照組臨床確診的200例患者中，外周血T-SPOT.TB檢測陽性為192例，陰性為8例；分泌物金胺O涂片鏡檢找分枝桿菌陽性為71例，陰性為129例；分泌物MGIT 960培養陽性115例，經菌種鑒定均為結核分枝桿菌；PPD試驗陽性者127例，陰性者73例。以臨床確診患者為標準，觀察組和對照組患者T-SPOT.TB檢測陽性率均明顯高于金胺O涂片鏡檢、分泌物MGIT 960培養、PPD試驗，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。兩組患者間T-SPOT.TB與PPD試驗檢測差異有統計學意義(P值<0.05)。具體見表1。

討 論

由于長期使用糖皮質激素等各種免疫抑制劑的患者免疫功能下降，結核感染的發生率遠高于普通人群，但其臨床表現及肺部影像學檢查多不典型，難以及時確診[7-8]，故筆者回顧性分析各檢測方法對需要采用免疫抑制劑治療的患者并發結核病時的檢測效果。

研究結果顯示，對照組和觀察組患者分泌物涂片及培養的陽性率組間差異均無統計學意義(P值均>0.05)，提示傳統方法檢測兩組患者結核感染的能力無變化，對是否使用免疫抑制劑的結核病患者診斷價值一致；而在PPD試驗檢測中，觀察組的陽性率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，降低了對免疫抑制患者罹患結核病的診斷作用；有報道認為，PPD試驗可檢測體內T淋巴細胞的免疫變態反應，當患者服用免疫抑制藥物時，可致機體內T淋巴細胞免疫反應受到抑制，同時抑制了細胞的遲發型變態反應，導致PPD皮膚試驗陽性率較非免疫受損患者低[9]，故需陽性率更高、檢驗時間更短的檢測方法來輔助診斷。

目前，臨床應用的IGRA技術主要有兩種：其一是采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunospot assay, ELISA)檢測全血中致敏T細胞再次受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放γ干擾素的水平，稱為IGRA-ELISA；其二是采用酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)測定PBMC中能釋放γ干擾素的效應T細胞數量，稱為T-SPOT.TB。T-SPOT.TB是以結核分枝桿菌復合群特有的ESAT-6和CFP-10抗原作為特異性抗原，當已結核感染的患者再次接觸上述抗原時，患者PBMC中存在的結核特異T淋巴細胞受刺激分泌γ干擾素，通過測定PBMC中釋放γ干擾素的效應T細胞數量，判斷是否結核感染，對輔助診斷活動性結核病與結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定參考價值。由于ESAT-6和CFP-10在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中缺失，故可以提高T-SPOT.TB對結核病檢測的特異度。

表1 兩組患者各方法檢測的情況及比較

注括號外數值為患者例數，括號內數值為率(%)；a：為組內T-SPOT.TB與各檢測方法陽性率進行的比較；b:為兩組間各檢測方法陽性率的比較

本研究顯示，觀察組和對照組的血T-SPOT.TB檢測的陽性率均明顯高于各組內分泌物金胺O涂片鏡檢及MGIT 960培養、PPD試驗，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，與李同心等[10]報道相近。以上兩組患者血T-SPOT.TB檢測的陽性率高達85.28%～96.00%，均遠高于本組傳統實驗室檢測方法的陽性率，提示T-SPOT.TB檢測陽性時較其他檢測方法有更好的判斷意義；同時在未使用免疫抑制劑的結核病患者中，血T-SPOT.TB檢測陰性結果對活動性肺結核的排除診斷具有較大意義[11]。

在本研究中，觀察組患者T-SPOT.TB陽性率低于對照組患者，差異有統計學意義(P<0.05)；可能與患者服用免疫抑制藥物后嚴重抑制了T淋巴細胞的免疫應答，或與T淋巴細胞數值下降有關，從而降低了觀察組的陽性檢出率。據Leidl等[12]研究顯示，在HIV感染者中，隨著免疫狀態的降低，T-SPOT.TB檢測的假陰性率逐漸增高；另外，Yang等[13]也認為CD4+T淋巴細胞計數對T-SPOT．TB的檢測結果起到很重要的作用，其陽性率和CD4+T淋巴細胞計數呈正比，當患者免疫抑制嚴重時，其T淋巴細胞計數也下降。據鐘一鳴等[9]、沈圓兵等[14]在對結締組織疾病患者的研究中顯示，血T-SPOT.TB檢測的敏感度僅為70.5%，但對T-SPOT.TB診斷假陰性相關危險因素分析中發現：年齡、糖皮質激素等免疫抑制劑的使用、淋巴細胞減少癥和低蛋白均不是T-SPOT.TB診斷假陰性的危險因素。本研究顯示，觀察組患者血T-SPOT.TB的陽性率較對照組低，其機制尚未完全清晰，有待進行更多的相關研究。本研究觀察組患者血T-SPOT.TB檢測陰性率達14.72%，提示可能存在LTBI風險；故使用免疫抑制劑患者采用T-SPOT.TB檢測陰性時，不能完全排除結核分枝桿菌感染可能，會出現假陰性可能。

國外文獻報道，血T-SPOT.TB檢測陽性結果與PPD試驗陽性結果相同，可診斷患者存在結核感染，但不能區分活動性結核病和LTBI[15-16]；而對于肺部有病灶或疑似結核病患者，國內有較多文獻報道認為，此類患者血T-SPOT.TB檢測的陽性率可達87.8%～96.0%，敏感度可達86.9%～90.9%[17-18]，與本研究觀察組和對照組血T-SPOT.TB檢測陽性率(85.28%和96.00%)相一致，可用于活動性結核病的輔助診斷。且T-SPOT.TB檢測陽性率高達96.00%，高于本研究其他傳統實驗室方法的檢測陽性率；提示對于既往無結核病病史、近期肺部出現活動性病變而疑似肺結核，并且血T-SPOT.TB檢測結果呈陽性的患者，通過鑒別診斷排除普通細菌感染、腫瘤及其他肺部疾病后，可考慮結核感染可能。

志謝廣州市胸科醫院譚守勇教授對本研究給予了多方面的指導