N-乙酰半胱氨酸對乙酸刺激仔豬腸黏膜生長及腸道屏障功能的影響

周 穎， 宋 轉， 張俊梅， 劉文凱， 余 魁，吳夢郡， 趙 迪,2， 王 蕾 ,2*， 易 丹,2， 侯永清,2，

（1.武漢輕工大學動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢430023；2.動物營養與飼料安全湖北省協同創新中心，湖北武漢430023）

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是左旋半胱氨酸以及谷胱甘肽合成的前體物質，具備供給巰基的能力，能夠消除活性自由基以及減少細胞的凋亡、增進生長，另外，還具有促進組織抗藥、緩解毒物損傷等多種藥理效應（Hou等，2015），臨床上應用于呼吸、神經系統的病癥成效顯著，然而NAC對乙酸刺激仔豬腸黏膜屏障功能及腸黏膜生長的影響鮮見報道。

腸道黏膜屏障功能的損害主要是由炎癥引發腸道黏膜損傷導致的，研究表明免疫失調以及腸道炎性因子失衡，可破壞黏膜的滲透性、黏附性以及完整性（Rendon等，2013），從而損傷腸道屏障

功能，進一步引發腸道炎性因子釋放失調、內部菌群轉移，最終誘發相關機體器官衰竭（Bahloul等，2017）。本研究采用乙酸刺激仔豬腸黏膜是基于化學因素導致的腸道黏膜組織出現相應的毀壞機制，病癥包含有腸黏膜彌漫性充血水腫，淋巴組織潰瘍，甚至出現部分黏膜缺失，造模簡單且穩定（李亞歡等，2017），在此基礎上，進而研究NAC對乙酸刺激仔豬小腸腸黏膜屏障功能及腸黏膜生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 NAC：市售醫藥級產品，純度不低于99.0%。乙酸（ACA）：國產分析純，純度≥98%。1.2 基礎日糧 試驗采用玉米-豆粕型飼糧作為基礎飼糧，參照NRC（2012）營養標準配制，滿足仔豬的營養需要量。基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成與營養水平（風干基礎）

1.3 試驗設計 選用18頭（28±2）日齡、平均體重（5.79±1.17）kg“杜×長×大”三元雜交健康仔豬，隨機分為對照組、ACA組和NAC組。每組6個重復，每個重復1頭豬。仔豬預飼時間為7 d，其中前兩組飼喂基礎飼糧，第三組在飼喂基礎飼糧的基礎上添加 0.05%的NAC。于正式試驗第15天，對ACA組和NAC組仔豬直腸灌注10 mL濃度為10%乙酸溶液，對照組灌注相應劑量的滅菌生理鹽水。第21天按仔豬每千克體重0.1 g由口腔灌入D-木糖溶液，1 h后從前腔靜脈采集血樣。然后采用戊巴比妥鈉進行肌肉注射，其中肌注濃度按仔豬體重每千克50 mg，待深度麻醉后屠宰。取小腸黏膜樣品，存于-80℃待測。

1.4 飼養管理與屠宰 試驗期間豬舍溫度保持22～25℃，并保證舍內清潔。試驗仔豬單體飼養，自由采食。于第21天屠宰收集樣品，采集距胃賁門大約5 cm處十二指腸，采集回腸、空腸中段樣品，所取腸段均為3 cm和10 cm的兩段相鄰腸段。3 cm腸段制作切片，10 cm腸段刮取腸黏膜，研磨，分裝，凍存于-80℃冰箱，待測。

1.5 指標測定

1.5.1 血漿D-木糖、EGF含量及血漿、小腸黏膜DAO活性的測定 血漿樣本中D-木糖水平檢測，采用間苯三酚比色法（張偉等，2011）。

取用腸黏膜0.5 g，冰浴勻漿，以3000 r/min離心15 min。采集上清液，使用放射免疫分析法檢測樣品中表皮生長因子（EGF）含量（方法靈敏程度：0.1 μg/mL，誤差：＜ 5%）。

血漿以及腸黏膜樣品中DAO活性的檢測參考張偉等（2011）的方法。

1.5.2 小腸黏膜形態結構的測定 分別取十二指腸、空腸、回腸各約3 cm長，制作組織切片（冷煒博等，2014)，光鏡下測量絨毛高度、隱窩深度，以及絨毛表面積，根據結果計算絨毛高度/隱窩深度。

1.5.3 小腸黏膜 DNA含量、RNA/DNA、TP/DNA比值的測定 參考Sambrook（2006)測定小腸黏膜中DNA和RNA濃度，計算TP/DNA和RNA/DNA比值。

1.5.4 小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的測定 采用RT-PCR檢測腸黏膜EGF、EGFR和AR mRNA表達量，其中引物序列表2。

RNA樣品處理：使用Trizol法提取Total-RNA。在260 nm吸光度條件下檢測RNA純度以及濃度 （使用NanoDropRND-2000 UV-VIS核酸蛋白檢測儀），然后選擇吸光度260 nm與280 nm比值大于1.8的總RNA試驗。

逆轉錄反應：將 4 μL 5×PrimeScriptRbuffer、1 μL PrimeScriptRRT enzyme mix、1.0 μL RT primer mix、10 μL DNA eraser-treated RNA 和 4 μL RNase free water混合制成20 μL反應體系，在37℃反應15 min，85℃反應5 s，cDNA于-80℃保存。

PCR 反應：20 μL 反應體系中包含 10.0 μL SYBRRPremix Ex TaqTM（2×）、0.4 μL ROX reference dye II （10×）、2.0 μL cDNA、6.8 μL RNase free water、0.4 μL forward primer （10 μM）、0.4 μL reverse primer （10 μM）。 反應條件為：95 ℃， 30 s；95℃，5 s和60℃，34 s，40個循環。反應結束后做產物的熔解曲線分析，檢驗PCR產物的特異性。以GAPDH作為內參，根據被測基因與內參基因的 Ct差值，使用 2-△△Ct法（Fu 等，2010）計算結果。1.6 數據處理 試驗數據經由Excel 2007整理后使用SPSS 23.0作統計分析，采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較，處理結果中P＜0.05則判定為存在顯著性差異，結果用“平均值±標準差”表示。

表2 RT-PCR的引物序列

2 結果

2.1NAC對ACA刺激仔豬血漿D-木糖、EGF含量及血漿、腸黏膜DAO活性的影響 由表3可知，與對照組相比，ACA組血漿中EGF含量降低了8.13%，血漿DAO活性提高了94.80%（P＜0.05），十二指腸DAO活性提高17.95%（P＜0.05）；與ACA組相比，NAC組血漿D-木糖和EGF含量及十二指腸DAO活性提高了 17.29%、26.20%、21.35%（P＜0.05）；血漿 DAO 活性降低了13.35%（P ＜0.05）。

表3 仔豬血漿D-木糖含量及血漿、腸黏膜DAO活性

2.2 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜形態的影響 由表4可知，相較于對照組仔豬，ACA組仔豬空腸絨毛高、十二指腸以及回腸絨毛高與隱窩深比值降低了14.03%、26.72%、14.97%，同時其十二指腸、空腸的絨毛表面積也下降了12.40%、37.11%（P＜0.05），十二指腸和回腸的隱窩深度分別提高了14.31%、8.14%（P＜0.05）；與ACA組相比，NAC組空腸絨毛高、十二指腸和回腸的絨毛高度/隱窩深度比值以及十二指腸和空腸絨毛表面積分別提升了 20.62%、29.41%、13.84%、41.23%、61%（P＜0.05），十二指腸和回腸的隱窩深度分別降低了7.79%、19.99%（P＜0.05）。

表4 仔豬小腸黏膜形態結構

乙酸灌腸對仔豬腸道形成刺激后，仔豬出現少動、嗜睡、無食欲、稀便、血便等病癥，經由光鏡觀察組織染色切片得出，對照組仔豬腸壁紋理清晰，上皮構成完全，絨毛平整且體例規整，有正常的上皮細胞結構，未出現膜充血和炎性細胞浸潤，且小腸絨毛未出現萎縮以及壞死等現象。ACA組小腸絨毛表現出較多殘缺，小腸腸壁變薄，腺體變少，上皮細胞充血水腫，杯狀細胞縮減，炎性細胞浸潤，表現出有差異的灶性糜爛，甚至出現部分組織脫落。此結果和高永利（2017）以及Ghalwash等（2017）的研究結果類似，NAC組仔豬腸黏膜形態構造相較于ACA組有明顯提升。

2.3 NAC對ACA刺激仔豬腸黏膜細胞生長的影響 由表5可知，與對照組相比，ACA組回腸RNA/DNA比值和TP/DNA比值分別降低了38.91%和 26.35%（P＜0.05）；與 ACA組相比，NAC組十二指腸和空腸DNA含量、回腸RNA/DNA比值及十二指腸、空腸和回腸TP/DNA比值分別提高了 56.36%、13.51%、63.69%、17.29%、32.97%、34.03%（P ＜ 0.05）。

表5 仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA、TP/DNA比值

2.4 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的影響 由表6可知，與對照組相比，ACA對小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平沒有顯著影響；與ACA組相比，NAC組回腸EGF mRNA水平提高了90.17%（P＜0.05）。

表6 仔豬小腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平

3 討論

3.1 NAC對ACA刺激仔豬血漿D-木糖含量及血漿、腸黏膜DAO活性的影響 仔豬口腔灌服D-木糖后，經由小腸吸收，最后直接隨尿液排出，過程中不被動物機體所利用，所以將D-木糖吸收量的測定作為腸道吸收能力常用的評定途徑 （楊彩梅等，2005)。本試驗中，飼糧中添加NAC可以提高血漿D-木糖含量，說明NAC可以提高小腸吸收功能，這與Hou等（2012）研究結果一致，日糧中添加NAC可以提高磷酸脂多糖（LPS）刺激仔豬D-木糖含量。

DAO存在于哺乳動物體內，其可參與腸道黏膜組織代謝，腸黏膜因各種原因受到損傷后導致胞內DAO大量進入血液。由此可見，血液中DAO含量能夠反映腸黏膜結構完整性 （劉飛飛等，2015）。研究表明，腸道絨毛的損傷能夠導致血液中DAO濃度上升，從而導致腸道組織活性下調，具體機理為腸道對自身應激損傷進行自我修復時DAO活性上升或下降（許文達等，2016）。本試驗中，ACA組刺激提高了的血漿DAO活性，同時又降低了小腸中DAO活性，這表明乙酸刺激給仔豬腸黏膜造成了損傷。有報道指出，補充NAC可以緩解炎癥性腸病所引起的腸黏膜病癥如充血、水腫、潰瘍等，同時也可以抑制腸道細胞的凋亡（Hou 等，2015）。 楊晨等（2017）研究證明 NAC 能夠有效減輕黃疸病癥大鼠腸道屏障功能的損傷。本試驗中NAC緩解了乙酸刺激所致的血漿DAO活性上升以及小腸黏膜DAO活性降低，說明NAC對腸道黏膜的損傷起到了一定的緩解作用。研究表明，NAC可以緩解磷酸脂多糖刺激所致的血漿DAO活性升高以及小腸黏膜DAO活性的降低（Hou 等，2012）。

3.2 NAC對ACA刺激仔豬小腸黏膜形態的影響 仔豬的腸道系統處于快速生長發育階段，腸道屏障功能的穩定依靠完整的腸黏膜細胞來維持（晏利瓊等，2016）。小腸作為消化道內重要的一部分，除了正常屏障功能外，還能吸收養分以及輸送養分至其他部位，所以腸道黏膜形態對其功能的體現尤為重要（王蕾等，2010）。仔豬腸道黏膜形態的評定主要根據其物理形態判定，判定主要指標有絨毛高度、隱窩深度、絨毛表面積、絨毛高度與隱窩深度之比，小腸黏膜的形態表現出小腸消化吸收能力的高低（黃其春等，2014）。其中絨毛高度與細胞數量呈顯著相關，隱窩具有分泌功能，其深淺反映了腸上皮細胞生成率，絨毛高度與隱窩深度的比值常用來表示上皮細胞的更新代謝程度（湯海鷗等，2014），比值降低表明動物腸道黏膜受損，升高則表明黏膜細胞生長良好，功能改善。本試驗研究結果顯示乙酸刺激降低了小腸的絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度的比值和絨毛表面積，說明乙酸刺激對小腸道黏膜造成了損傷，添加NAC后可有效緩解ACA刺激造成的這些負影響，表明NAC能夠在一定程度上增加腸上皮細胞的代謝替換速率，加快細胞生長，強化細胞自我恢復功能，使乙酸刺激引發的腸黏膜形態損傷得到緩解。

3.3 NAC對ACA刺激仔豬腸黏膜細胞生長以及腸黏膜EGF、EGFR及AR mRNA水平的影響腸道黏膜蛋白質（TP）及其DNA對小腸細胞的生長和修復極其重要，單位組織中DNA含量的變化可以反映出細胞數量的多少（林謙等，2016），RNA與DNA的比值能夠準確反映蛋白質合成水平；TP/DNA比值可用來衡量細胞大小和蛋白質沉積效率的高低 （Foley等，2016)。本試驗結果表明，NAC補充能夠使乙酸刺激仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA比值及TP/DNA比值上升，表現出NAC補充能夠緩解乙酸刺激所引發的生長抑制，其原因是由于過氧化物受到抑制而引發DNA斷裂以及因化學因素誘發的細胞轉變，令DNA甲基轉移酶活性增強，從而修復受損DNA。蛋白質以及DNA含量上升說明腸細胞合成代謝加快（Groschwitz等，2009），于修善小腸形態結構至關重要，NAC補充或許是經由增進腸黏膜蛋白合成途徑使得受損腸道得以修復。

表皮生長因子（EGF）是機體腸道受損后自我修復與再生的關鍵內源調控因素之一，主要通過增進細胞增殖從而加速損傷修復 （劉淑杰等，2016）。表皮細胞生長因子受體（EGFR）作為受體酪氨酸激酶，與其結合的配體還有TGF-α、Amphiregulin （AR）、Epiregulin、HB-EGF 等 （劉淑杰等，2014），與EGF等配體結合后經由細胞內信號轉導通路表達，從而調控相關基因表達。回腸EGF以及EGFR的mRNA水平在飼糧補充NAC以后得到顯著提升，其修復的機制或許是經由EGF及其受體在組織中呈正向表達，進一步激活酪氨酸激酶、蛋白G和磷酸脂酶C，進而使鈣離子濃度變化，促進糖酵解過程，增加損傷的自我修復與增殖再生，從而避免其向內發展（劉淑杰等，2016）。與此同時，EGF能夠抑制細菌在黏膜遷移（吳秀群等，2011），加快與其相關的內源性因素提升，加速上皮細胞和成纖維細胞轉移，實現創傷的愈合（胡瑩瑩等，2013）。研究表明EGF直腸灌注應用到急性腸炎上成效顯著 （蘇鳳哲等，2015）。EGF家族中AR通過與EGFR結合激活EGFR信號通路，減少上皮細胞壞死，從而保證腸黏膜形態結構齊整性（劉淑杰等，2016)，最終達到NAC補充后對腸道損傷修復與保護的效果。

4 結論

飼糧中添加0.05%的NAC可以在一定程度上緩解ACA刺激導致的小腸黏膜損傷，促進腸黏膜生長，這可能與EGFR信號通路有關。