微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定飼料中的色氨酸

趙 艷 ， 宋 軍 ，3*， 張艷紅 ， 楊發樹 ， 張鳳枰 ， 劉耀敏

（1.四川威爾檢測技術股份有限公司，四川成都 610041；2.通威股份有限公司，四川成都 610093；3.西北農林科技大學，陜西楊凌 712100）

色氨酸通常以游離或結合態廣泛存在于生物體中，是人類和動物必需的8種氨基酸之一，其作為一種功能性的氨基酸，在提高動物的攝食量、生長性能，促進營養物質的消化吸收等方面發揮著重要的作用 (王榮發等，2011；陳娥英等，2006；蘇有健等，2005）。因動物體本身不能合成色氨酸，所以飼料中色氨酸的平衡和補充就顯得十分重要，而準確檢測飼料及其原料中色氨酸的含量，對于保證飼料的質量具有重要意義。目前，測定色氨酸的方法有多種，包括分光光度法 (徐禮生等，2014）、毛細管電泳法 (楊曉云等，2001）、電化學法 (楊曉云等，2001）、氨基酸分析儀法（Li等，2015）、反相高效液相色譜法 (楊永麗等，2016； 李成成等，2016；Cevikkalp 等，2016；Yust等，2004）和高效液相色譜串聯質譜法 （王佳佳等，2016；徐開成等，2016）等，其中以反相高效液相色譜法最為常用。色氨酸通常以蛋白質的形式存在于樣品中，首先需要進行水解，解離為游離態后才能測定。目前通常用常規堿水解法（GB/T 18246-2000，2001）。然而常規堿水解方法耗時，步驟繁瑣，且水解過程不易控制。而采用微波輔助蛋白質水解樣品，快速、簡便，特別是易于控制堿水解條件，重現性好。國內外采用微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定飼料中色氨酸的報道甚少，本文充分利用微波蛋白質水解儀的優勢，既節約了試劑，又節省了樣品前處理時間，旨在為飼料中色氨酸的質量控制提供一種檢測方法選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料 Thermo U3000超高效液相色譜儀，DAD檢測器，Chromeleon色譜管理系統，美國Thermo Scientific公司；CP225D電子分析天平，德國Sartorius公司；ETHOS 1微波水解儀，意大利Milestone公司；Allegra 64 R離心機，BECKMAN COULTER公司；KQ 5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

L-色氨酸（L-Trp，純度 99.5%）標準品，美國sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（色譜純），美國Fisher公司；磷酸二氫鉀、乙酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑公司；其他試劑均為優級純；水為Milli-Q Gradient超純水。

飼料原料及成品：四川當地飼料市場采集。

1.2 標準溶液的配制 準確稱取適量色氨酸標準品100.0 mg（純度 99.5%），用適量水和數滴0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解，并用水定容至100 mL，配成質量濃度為1 mg/mL標準儲備溶液，可根據需要稀釋成系列標準溶液。

1.3 HPLC分析條件 色譜柱：Syncronis C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm； 流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測器：DAD檢測器，檢測波長：220 nm；流動相：等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈＝90+10（V+V）。

1.4 供試樣品溶液的制備

1.4.1 常規堿水解法 參照國標GB/T 18246-2000堿水解方法進行樣品前處理。所有樣品重復3次測定，結果取平均值。

1.4.2 微波輔助蛋白質堿水解法 將樣品粉碎，準確稱取樣品20 mg（精確至0.01 mg）于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.5～1 mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐內加入5 mol/L氫氧化鈉溶液120～150 mL，蓋好水解罐。將水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護樣品，重復3次。在1000 W功率條件，常溫-160℃升溫20 min，160℃溫度保持30 min，當溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解槽，將微波水解瓶逐一取下后，將水解液全部轉移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的鹽酸溶液調至中性，超純水定容至25 mL。搖勻后，10000 r/min 離心 10 min，過 0.22 μm 濾膜，待高效液相色譜上機檢測。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 微波輔助蛋白質水解條件的優化 考察不同微波水解溫度（140、150、160、170 ℃），以及不同微波水解溫度保持時間（20、30、40 min）對實驗結果的影響，最終選擇160℃溫度保持30 min為最佳條件。

2.1.2 微波堿水解法與常規堿水解法的比較 為證明方法的可靠性，在采用微波堿水解測定樣品中色氨酸含量同時，運用國標GB/T 18246-2000的常規堿水解法110℃水解20 h進行測定，并將測得的結果用T檢驗法進行了比較，結果見表1。結果表明，兩種水解方法測定結果的相對偏差均小于3.0%，經T檢驗，微波堿水解法與國標方法常規堿水解法測定結果不存在顯著差異（P＞0.05），在所選擇的條件下微波輔助蛋白質堿水解測定結果與國標方法常規堿水解法一致。

表1 兩種水解方法色氨酸含量的比較（n=3）%

2.2 高效液相色譜分析條件的選擇

2.2.1 波長的選擇 利用DAD二極管陣列檢測器獲得色氨酸光譜數據，得出其在190～800 nm范圍內的最大吸收波長。色氨酸在220 nm和280 nm波長下有較強吸收，220 nm比280 nm的響應高6倍，因此，選用220 nm作為檢測波長，從而降低色氨酸的檢出限。

2.2.2 流動相的選擇 為了使色氨酸與其他組分達到完全分離，分別以甲醇/水、甲醇/乙酸鈉溶液、甲醇/磷酸、甲醇/磷酸二氫鉀溶液、乙腈/磷酸二氫鉀溶液作為流動相，考察這些體系對色氨酸分離情況的影響。結果表明，選擇甲醇/乙酸鈉溶液體系時部分飼料中的雜質會對色氨酸的分離造成干擾，在改用乙腈/磷酸二氫鉀溶液作為流動相后，分離情況大為改觀，而且用乙腈作流動相可以大大降低流動相的背景干擾。另外，研究了乙腈體積分別為5%，10%和15%時，色氨酸的出峰效果。結合色氨酸的保留時間，色譜峰的對稱因子，干擾情況等一系列實驗，最終選擇乙腈/磷酸二氫鉀溶液（10∶90，V/V）作為流動相。本實驗在所選擇的條件下，標準品和飼料樣品的分離效果見圖1和圖2。

圖1 色氨酸標準品的色譜圖

圖2 飼料中色氨酸的色譜圖

2.3 線性關系及檢出限的考察 分別準確吸取適量色氨酸標準儲備溶液，用水配制成濃度分別為 0.2、2.0、4.0、20.0、40.0 μg/mL 的色氨酸系列標準工作液。按照上述色譜條件進樣，以色氨酸質量濃度為橫坐標（x），對應的峰高為縱坐標（y），繪制標準曲線。回歸方程：y=3.3965x＋0.0937，相關系數為1.0000，表明濃度為0.2～40 μg/mL時線性關系良好。以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，本方法檢出限為0.025 mg/g，定量限為0.075 mg/g。

2.4 方法的精密度和回收率實驗 為研究方法的精密度和可靠性，在不同種類的飼料樣品中分別添加3個濃度水平的標準溶液，每水平6個平行樣，按照1.4.2樣品溶液制備方法進行處理，按照1.3儀器條件進行測定，回收率結果見表2。結果顯示，色氨酸的回收率為93.0%～95.5%，相對標準偏差為1.26%～2.72%，符合實驗要求。

表2 色氨酸的回收率和測定的相對標準偏差（n=6）

2.5 樣品中色氨酸的測定 按上述方法，分別測定飼料原料及成品中的色氨酸含量，結果見表3。

表3 樣品中色氨酸含量測定結果（n=4）

3 結論

利用微波輔助蛋白質水解-反相高效液相色譜法測定飼料中的色氨酸，方法簡便快速、重現性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測結果可信度高，可以滿足飼料及其原料中色氨酸的檢測需要，同時為飼料配方調整提供理論依據，對于指導飼料企業生產、加強飼料產品控制具有十分重要的意義。