青貯飼料中纖維素降解細菌的分離與鑒定

孟建宇， 徐慧欣， 納荷芽

（內蒙古農業大學生命科學學院應用與環境微生物實驗室，內蒙古呼和浩特010011）

青貯飼料是將含水率為65%～75%的青綠飼料經切碎后，在密閉缺氧的條件下，通過厭氧乳酸菌的發酵作用，抑制各種雜菌的繁殖，得到的一種粗飼料（玉柱和孫啟忠，2011；張玉婷和胡柏林，2008）。青貯飼料可為家畜提供具有良好營養和口感的冬季青綠飼料，還可以解決大量秸稈廢棄物帶來的環境問題。為進一步改善青貯飼料的口感和營養，越來越多的研究將重點放在生物性青貯添加劑上（丁琳等，2017；侯美玲，2017），尤其是微生物制劑和纖維素酶制劑的添加已成為牧草營養學中的研究熱點 （黃勤樓等，2017；原現軍等，2013）。

纖維素酶可將秸稈纖維類組分進行降解，降低纖維含量，增加乳酸菌發酵所需的底物，生成乳酸，降低pH，抑制有害菌的生長，減少營養物質的損失，并利用菌群代謝的各類活性物質調節動物的免疫等，以改善青貯飼料的品質（丁琳等，2017；宋鴿等，2017；趙士萍等，2016；Guo，2014）。纖維素酶產生菌通過產生纖維素酶，降解飼料中難以利用的纖維素為單糖或雙糖等可溶性糖，為乳酸菌、酵母菌的發酵提供更多的糖分，從而有助于其在青貯中發揮自身有益作用，促進青貯發酵（郭威等，2017）。

目前用于青貯飼料研究與應用的纖維素酶主要來源于真菌，但所應用的菌株仍存在纖維素降解能力低、活性不夠穩定、產酶成本較高和pH作用范圍小等問題。因此，獲得高效降解纖維素的菌株對提高青貯飼料營養品質及利用率具有重要的意義（黃勤樓等，2017）。本試驗以青貯飼料為研究對象，通過富集培養（李詳和黃勇，2010；張晶，2007）富集樣品中的纖維素降解菌，在CMC-Na培養基上分離純化，由16S rDNA序列分析法對篩選到的纖維素降解菌進行鑒定，為今后的纖維素降解菌在青貯飼料中的高效利用提供更多的基礎信息和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 青貯飼料由內蒙古天寶生物科技有限公司提供。

1.2 培養基 CMC-Na培養基：羥甲基纖維素鈉5.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO42.0 g/L， 酵母抽提物 2.0 g/L，瓊脂 20 g/L， 蒸餾水 1000 mL，pH 8.8，121℃滅菌 30 min。

1.3 菌種的富集篩選和分離純化 將青貯飼料樣品用無菌水振蕩浸提過夜，吸取上清液注入到富集培養基中，放于恒溫培養箱中28℃倒置培養3周。從富集培養瓶中吸取菌液，然后進行稀釋，將稀釋好的四個梯度（10-2、10-3、10-4、10-5）的菌懸液分別吸取1 mL，加到CMC-Na（自然pH）培養基平板上，用涂布器涂布均勻，在恒溫培養箱28℃培養2～3 d后，挑取單菌落再于培養基上劃線純化，重復以上步驟直到得到純的單菌落。

1.4 菌種的16S rDNA序列分析 純菌DNA的提取參考胡曉紅等（2008）的方法。選用細菌通用引物對27F（5'-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3'） 和 1492R （5'-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'）進行PCR擴增。PCR產物采用SYBR GreenⅠ作為標記，在1%（W/V）瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中進行電泳測定。以Marker DL2000作為對照，在紫外燈下觀察DNA譜帶，照相。將PCR產物交由北京華大公司測序。獲得的核酸序列用GenBank數據庫中的序列進行Blast相似性比較。

1.5 酶活的測定 采用DNS法 （段杰，2015）對纖維素降解菌的酶活進行測定。將分離得到的單菌落接種于液體培養基，在常溫條件下搖菌三天。吸取振蕩渾濁的菌夜2 mL，在3000 r/min，常溫下離心3 min后，吸取1 mL的上清液即粗酶液于試管中，加1mL 1.0%的CMC緩沖液后于50℃恒溫水浴中反應30 min，取出后加入2.5 mL DNS試劑，于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后用1 cm比色皿在540 nm下測定其OD值，查閱葡萄糖標準曲線，計算含糖量。按照IUPAC推薦的國際標準方法測定，以IU/mL表示。一個酶活性單位（IU）定義為1 min內轉化底物產生1.0 μmol還原糖 （以葡萄糖計）所需的的酶量。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離篩選 經過反復劃線分離 純 化 ， 得 到 Gs7、Gs10、Gs3、Gs9、Gs11-2 和Gs12六株降解纖維素的細菌。其中，菌株Gs3、Gs7、Gs9和Gs12的菌落形態特征基本相同，為圓形凸起，乳白色，邊緣光滑且光澤不透明；Gs10的菌落形態特征為圓形凸起淡黃色，邊緣光滑且有光澤不透明；Gs11-2的菌落形態特征為均勻圓形凸起，乳白色（表 1）。

表 1 菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2、Gs12的菌落形態特征

2.2 菌株的鑒定 以細菌16S rDNA通用引物27F 和 1492R 對菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2和Gs12的DNA進行PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖1所示。擴增片段長度約為1500 bp，符合預期片段長度，為目的片段。用NCBI數據庫的Blast程序對獲得的16S rDNA序列進行比對分析，發現6株纖維素降解細菌分別來源于2個不同的屬， 即 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均屬于乳桿菌屬 （Lactobacillus），Gs11-2屬于醋菌屬（Acetobacter），其同源性都為 100%（表 2）。

圖1 菌株的16S r DNA片段的擴增結果

表2 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

2.3 菌株的酶活測定 采用DNS法對分離到的6株纖維素降解細菌的纖維素酶活進行了測定。菌株Gs3的相對酶活為36.20 IU，菌株Gs7的相對酶活為24.24 IU，菌株Gs9的相對酶活為61.70 IU，菌株Gs10的相對酶活為35.57 IU，菌株Gs11-2的相對酶活為25.50 IU，菌株Gs12的相對酶活為35.89 IU。

3 結論

纖維素酶廣泛應用于醫藥、食品、棉紡、環保及可再生資源利用等領域，其是一種安全、高效的生物催化劑，可水解纖維素、半纖維素成為可被動物或乳酸菌利用的糖，有利于發酵，降低青貯料中的粗纖維，同時釋放出細胞內的各種營養物質，提高有機物利用率，從而改善飼料的營養價值和消化利用率（黃勤樓等，2017；廖奇等，2017；趙士萍等，2016）。自然界中能夠產生降解纖維素酶及降解作物纖維素的微生物很多，因此，纖維素降解菌的篩選是纖維素酶制劑生產及應用過程中最基礎的工作。本文從內蒙古的青貯飼料中分離得到了6株纖維素降解細菌，經16S rDNA序列分析，Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均 屬 于 乳 桿 菌 屬（Lactobacillus），Gs11-2 屬 于 醋 菌 屬 （Acetobacter）。其中，Gs9的纖維素酶活較高，為61.70 IU，是一株可應用于飼料微貯的微生物制劑參考菌株，值得進一步研究。