云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖抗肝損傷作用的研究

魏淑飛，左紹遠(yuǎn)，羅永會(huì)

（1. 九江學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，江西 九江 332000 ；2. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

蜂花粉營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)保健食品。多糖是蜂花粉的主要活性成分之一，有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂等多種生物學(xué)活性[1-2]。多糖的生物學(xué)活性通常與其純度及化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[3-5]，所以多糖提取工藝中脫蛋白方法尤為重要。由于受水文、地理、采集時(shí)間及季節(jié)等因素的影響，不同產(chǎn)地的蜂花粉多糖在多糖含量、單糖組成、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性、藥理學(xué)作用等方面均有一定差異。目前國(guó)內(nèi)對(duì)青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙、四川、湖北等油菜主產(chǎn)地的油菜蜂花粉多糖研究較多，而有關(guān)云南產(chǎn)的油菜蜂花粉多糖的研究目前尚未見(jiàn)有報(bào)道[6-7]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、木瓜蛋白酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒（南京建成生物研究所），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ˋR）。云南產(chǎn)油菜蜂花粉（云南永勝蜂業(yè)公司），多糖（大理大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提?。?。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠50只，雌雄兼用，體重20～30 g，由大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK 2014-004。

1.3 主要儀器

HH-4 數(shù)字恒溫水浴鍋（國(guó)華電器），SAH-C水浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾電器），722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器公司）。

1.4 方法

選取昆明種小鼠50只，雌性各半，體重20～30 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成RBPP高、中、低劑量組、正常對(duì)照組和肝損傷模型組。RBPP高、中、低劑量組分別灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液10 ml/kg，正常對(duì)照組與肝損傷模型組則給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d，末次給藥2 h后，模型組和RBPP高、中、低劑量組腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液10 ml/kg，正常對(duì)照組腹腔注射等體積的花生油溶液。禁食（不禁水）12 h，各組小鼠斷頭取血，離心取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)血清AST、ALT活檢、肝組織MDA含量及SOD活性。剖腹取小鼠肝臟，置于生理鹽水中漂洗，除去血漬，濾紙拭干，取每只小鼠肝臟的相同部位，制作病理切片，常規(guī)HE染色，觀察各組小鼠肝組織學(xué)形態(tài)的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異按方差分析進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清AST、ALT顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。與模型組比較，RBPP各劑量組血清AST均下降，但僅RBPP中、高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且RBPP低、中、高劑量組小鼠血清ALT的含量均顯著降低（P＜0.01）。

表1 RBPP對(duì)肝損傷小鼠血清AST、ALT含量的影響（± s，n=8）

表1 RBPP對(duì)肝損傷小鼠血清AST、ALT含量的影響（± s，n=8）

注：△P＜0.01 vs 正常對(duì)照組，** P＜0.01 vs 模型組

組別 AST/IU·L-1 ALT/IU·L-1正常對(duì)照組 69.16±9.74 54.43±4.70模型組 126.38±24.70△ 151.33±13.16△RBPP 100 mg/(kg·d)組 123.58±33.57 122.13±19.43**RBPP 150 mg/(kg·d)組 86.77±14.90**110.94±4.87**RBPP 300 mg/(kg·d)組 85.87±26.78** 97.24±11.13**

2.2 對(duì)肝損傷小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型組SOD活性顯著下降，而MDA含量升高，表明小鼠注射0.1 % CCl4后，小鼠抗氧化能力明顯降低。而RBPP能明顯拮抗CCl4的毒性作用，使小鼠抗氧化能力回升。與模型組比較，RBPP各劑量組均可增強(qiáng)CCl4所致急性肝損傷小鼠抗氧化能力，使小鼠肝臟SOD活性明顯回升，MDA含量顯著下降。且高劑量組SOD活性已恢復(fù)到了正常水平。

表2 RBPP對(duì)肝損傷小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響（± s，n=8）

表2 RBPP對(duì)肝損傷小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響（± s，n=8）

注：△P＜0.01 vs 正常對(duì)照組，** P＜0.01 vs 模型組

組別 SOD/U·mg prot-1MDA/U·mg prot-1正常對(duì)照組 144.88±6.04 2.24±0.44模型組 116.42±8.52△ 8.59±0.48△RBPP 100 mg/(kg·d)組 134.72±7.48** 6.58±0.61**RBPP 150 mg/(kg·d)組 135.82±10.8** 3.73±0.17**RBPP 300 mg/(kg·d)組 145.46±12.08** 3.36±0.56**

2.3 對(duì)肝損傷小鼠的肝組織形態(tài)的影響

結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，肉眼觀：正常對(duì)照組小鼠肝臟顏色呈紅褐色，質(zhì)軟，模型組小鼠肝臟水腫，邊緣變鈍，肝臟顏色灰褐色。鏡下：正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，條索狀結(jié)構(gòu)以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇清晰可見(jiàn)；模型組小鼠正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞條索狀結(jié)構(gòu)解離，肝細(xì)胞明顯水腫，可見(jiàn)較多的點(diǎn)狀死灶，并伴有炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)；RBPP低劑量組與模型組對(duì)比，肝細(xì)胞水腫變性，點(diǎn)狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改善不明顯；RBPP中劑量組肝細(xì)胞水腫、壞死較模型組有明顯減輕；RBPP高劑量組較模型組肝細(xì)胞損傷有顯著減輕，肝細(xì)胞排列較整齊，水腫變性、壞死明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，只有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖對(duì)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響（×200）

3 討論

目前認(rèn)為，CCl4建立的肝損傷模型主要機(jī)制與自身產(chǎn)生的自由基及其產(chǎn)物有關(guān)，CCl4進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的自由基，在肝臟細(xì)胞色素酶P450的作用下分解成三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基的破壞能力極強(qiáng)，不僅破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞器，且攻擊細(xì)胞膜上的磷脂質(zhì)分子，共價(jià)結(jié)合膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子，致使機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝紊亂，破壞肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞失去正常的生理功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[8]。因此SOD及MDA含量可間接表示云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖小鼠的肝臟保護(hù)作用，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖300，150，100 mg/kg劑量組均可顯著提高肝組織SOD活性，降低肝組織MDA含量。表明云南油菜蜂花粉多糖具有顯著的清除自由基、保護(hù)肝臟能力。

AST、ALT為測(cè)定肝功能最主要的兩種酶，ALT存在于肝細(xì)胞內(nèi)，AST主要分布在線粒體；當(dāng)肝細(xì)胞受損傷時(shí)，細(xì)胞膜最先受損，因而ALT最先進(jìn)入血液，只有當(dāng)肝細(xì)胞損傷累計(jì)到線粒體時(shí)，血液中的AST才會(huì)升高。有研究表明，CCl4制作的肝損傷模型，在小鼠腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液24 h后，AST、ALT含量達(dá)到最高峰[9]。但由于CCl4制作肝損傷模型的死亡率很高，達(dá)到80 %以上[10]，所以本實(shí)驗(yàn)于腹腔注射0.1 % CCl4花生油溶液12 h后處死檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組AST、ALT升高顯著，表明模型建立成功。與模型組比較，不同劑量的多糖給藥均能顯著的降低小鼠血清AST、ALT含量，提示云南產(chǎn)油菜蜂花粉多糖具有較強(qiáng)的保護(hù)肝損傷的能力。