12種培美曲塞新型衍生物的抗菌活性分析

劉 秀, 賈玉萍，賈慶文，馬玉奎，郭中坤,3，王可洲,3*

（1. 濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南250101；3. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山東 濟(jì)南 250002）

二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）抑制劑能選擇性地與DHFR結(jié)合，阻止或抑制正常底物與之結(jié)合，從而阻礙機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必須的物質(zhì)──葉酸的正常代謝，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[1]。培美曲塞（pemetrexed，PMX）作為常用的DHFR抑制劑之一，主要用于惡性胸膜間皮瘤及非小細(xì)胞肺癌的二線(xiàn)治療[2-3]。有研究顯示，某些抗腫瘤藥物有可能兼有抗菌作用[4-5]。通常被用作抗腫瘤藥的培美曲塞及其衍生物的抗菌活性目前少有報(bào)道。本研究選擇12種DHFR抑制劑類(lèi)培美曲塞衍生物，采用優(yōu)化后的MTT法檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）的半數(shù)最低抑菌濃度（half maximal inhibitory concentration，MIC50）及最低殺菌濃度（minimal bactericical concentration，MBC），并以此為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)待測(cè)化合物的抗菌活性，篩選出具有抗菌活性的化合物以便進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

12種培美曲塞衍生物（A1～A12，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，青島海博生物）；0.9 %氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)）；溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT，Biosharp公司）；DMSO（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；青鏈霉素混合液（100×，Solarbio公司）；培美曲塞二鈉（PMX，天津德太然生物醫(yī)藥）。

1.2 儀器

Spx-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅）；HF safe-1500TE生物安全柜（上海力申）；Spectra Max I3多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；JW-1032常溫低速離心機(jī)（安徽嘉文）。

1.3 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌（8099），金黃色葡萄球菌（ATCC6538），白色念珠菌（ATCC10231），由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 菌懸液制備

將保存于-80 ℃的甘油凍存菌種采用平板劃線(xiàn)法接種于相應(yīng)培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)（各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[6]見(jiàn)表1）后，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

表1 各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

2.2 適于抗菌活性測(cè)定的MTT法的建立[7]

2.2.1 最適檢測(cè)波長(zhǎng)及DMSO用量的確定 將菌懸液用0.9 %氯化鈉注射液按1:2、1:4比例稀釋后，取原液和稀釋菌液加入96孔板，每孔100 μl，之后加入20 μl MTT溶液，將菌株置于恒溫培養(yǎng)箱（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為37 ℃，白色念珠菌為28℃）中培養(yǎng)60 min后，1000 r/min離心10 min，小心吸去上清，各加入0，100，150 μl DMSO溶解MTT溶液與細(xì)菌形成的甲臜結(jié)晶，震蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在400～700 nm范圍內(nèi)每隔50 nm的光密度值（OD），以O(shè)D值最大時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)作為最適檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)設(shè)置空白孔及調(diào)零孔，各濃度至少3個(gè)平行。

2.2.2 最適細(xì)菌濃度的確定 取3種菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液，用適量0.9 %氯化鈉注射液稀釋至1×109cfu/ml后，再10倍系列稀釋8個(gè)梯度，測(cè)定

2.3 抗菌活性測(cè)定

2.3.1 測(cè)定MIC50利用建立的MTT法測(cè)定抗菌活性，具體步驟如下：將培養(yǎng)好的菌液10倍系列稀釋至107cfu/ml左右，取100 μl加至96孔板。稱(chēng)取適量待測(cè)化合物（A1～A12）及PMX，配制成200 mmol/L的母液，再用液體培養(yǎng)基梯度稀釋?zhuān)魅?00 μl加至相應(yīng)孔中，使終濃度分別為200，40，8，1.6，0.32 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔[青鏈霉素混合液（1×）]，96孔板四周孔用液體培養(yǎng)基填充。加藥完畢，96孔板置于相應(yīng)培養(yǎng)溫度中培養(yǎng)20 h（真菌44 h）后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將96孔板從培養(yǎng)箱中拿出，1000 r/min離心10 min，小心吸去上清，加入DMSO 100 μl，震蕩5 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定震蕩之后的96孔板在500 nm處的光密度值（OD500）。用下式計(jì)算待測(cè)化合物對(duì)細(xì)菌/真菌的抑制率（%）：

抑制率（%）=[1-（加藥組OD500-調(diào)零孔OD500）/（空白對(duì)照組OD500-調(diào)零孔OD500）]×100 %

2.3.2 MBC測(cè)定[9]MIC50測(cè)定同時(shí)，取未見(jiàn)明顯渾濁的孔內(nèi)培養(yǎng)物10 μl于1.5 ml離心管中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋100倍混勻后，吸取100 μl涂布于事先準(zhǔn)備好的TSA或SDA平板上培養(yǎng)，未見(jiàn)菌落數(shù)生長(zhǎng)或平均菌落數(shù)小于10個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為其MBC。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 建立適于抗菌活性測(cè)定的MTT法

3.1.1 最適檢測(cè)波長(zhǎng)及DMSO用量測(cè)定結(jié)果 MTT溶液與大腸桿菌形成的甲臜結(jié)晶經(jīng)DMSO溶解后，在450～600 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，且不同濃度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而沒(méi)有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在650 nm左右；MTT與金黃色葡萄球菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后，在450～550 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，且有明顯的特征性吸收峰，不同濃度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而沒(méi)有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在600 nm左右；MTT與白色念珠菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后，在400～550 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，沒(méi)有明顯的特征性吸收峰。以上結(jié)果提示：是否使用DMSO對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響；不同用量的DMSO得到的吸收峰特征圖較為一致，且各OD值接近，說(shuō)明使用100 μl的DMSO能將甲臜充分溶解。同時(shí)，菌液濃度過(guò)高時(shí)，得到的OD值較大，線(xiàn)性關(guān)系不好且特征性吸收峰不明顯，因此，菌液的使用濃度不宜過(guò)高。

3.1.2 確定測(cè)量范圍 不同濃度梯度菌液的OD570均值見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的菌液濃度為10，102，103，104，105，106cfu/ml時(shí)，6組數(shù)據(jù)兩兩之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均與107，108cfu/ml組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且107，108cfu/ml 2組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，當(dāng)菌液濃度低于106cfu/ml時(shí)，對(duì)OD570值的影響不顯著，因此，在進(jìn)行MTT檢測(cè)時(shí)，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌液的檢測(cè)范圍為107～108cfu/ml，白色念珠菌菌液的檢測(cè)范圍則為106～108cfu/ml。

表2 不同濃度梯度菌液的OD570均值

3.2 抗菌活性測(cè)定結(jié)果

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，12種培美曲塞衍生物對(duì)大腸桿菌及白色念球菌均無(wú)抑制作用，化合物A4、A7、A11、A12對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抑制效果，MIC50分別為7.05±4.67，1.11±0.2，14.12±0.54，9.86±2.31 μmol/L，并且當(dāng)這4種化合物的終濃度為200 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)菌的抑制率分別為97.15 %，98.21 %，97.12 %，97.80 %，均強(qiáng)于青鏈霉素混合液（1×）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率（96.76 %）。其中，A7的抑制效果最強(qiáng)，且重復(fù)性較好。以上結(jié)果提示：此類(lèi)系列藥物中某些化合物可能對(duì)某些革蘭陰性菌及真菌無(wú)效，對(duì)某些革蘭陽(yáng)性菌有效。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 12種培美曲塞衍生物對(duì)不同菌種的MIC50及MBC

4 討論

四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法又稱(chēng)MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。目前，該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選、細(xì)胞毒性檢測(cè)及腫瘤放射敏感性測(cè)定等領(lǐng)域[10-14]。藥物對(duì)細(xì)菌的作用檢測(cè)方面少見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌與MTT形成的甲臜在450～600 nm 處有較寬的吸收峰，在500 nm處有最大吸收峰，該結(jié)果與已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合[7,15]。通過(guò)對(duì)部分條件進(jìn)行優(yōu)化，完善了用于抗菌活性測(cè)定的MTT法[16-17]，這為之后藥物抑菌活性的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，優(yōu)化后的MTT法結(jié)果表明：部分培美曲塞衍生物具有抗腫瘤作用的同時(shí)，兼有抗菌活性[18-19]。此結(jié)果提示我們，此類(lèi)藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制是否與其抗菌活性有關(guān)、其他類(lèi)型的DHFR抑制劑是否也具有抗菌活性等藥理作用還需要進(jìn)一步研究，以期發(fā)現(xiàn)新的藥理活性，為臨床合理用藥提供可能。