響應面法優化馬鞭草總黃酮超聲波提取工藝研究及其抗氧化活性考察

邢佰穎，陳田雨，楊麗瑩，李 婷，高 鵬

（山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355）

馬鞭草（Verbena officinalisL.）又名土荊芥、鐵馬鞭等，原產于歐洲，主要生長于原野，在全世界的溫帶至熱帶地區均有分布。本品具有散瘀通經、清熱涼血、解毒消脹、止癢驅蟲的功效[1]。現代研究表明，馬鞭草主要含環烯醚萜糖苷類、黃酮類[2]、三萜類、甾醇等化學成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗早孕、調節免疫活性等作用[4]。目前對于馬鞭草的研究報道并不多見，本項目組在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝并研究其體外抗氧化活性，以期為該藥的研究開發提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-1100紫外可見光分光光度計（上海天美）；R201C型旋轉蒸發器（鞏義英峪高科儀器廠）；循環水式多用真空泵（鄭州長城）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；恒溫不銹鋼水浴鍋（上海樹立）；YP10002電子天平（上海光正）；JY1002分析天平（上海精密科學儀器公司）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma）；蘆丁對照品（純度：≥98 %，上海源葉，批號：Y01M7S10307）；馬鞭草（購自安徽亳州中藥材市場，經山東中醫藥大學萬鵬教授鑒定合格）；過氧化氫（天津富宇，批號：20161209）；L（+）-抗壞血酸，亞硝酸鈉，三氯化鋁，氫氧化鈉（分析純，國藥集團）。

2 方法

2.1 馬鞭草總黃酮超聲提取工藝的優化

2.1.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品5.00 mg，置入25 ml量瓶，加適量無水乙醇超聲使溶解，以無水乙醇定容，搖勻，配成0.2 mg/ml的蘆丁對照品溶液，備用。

精密移取蘆丁對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分別置入25 ml量瓶，加無水乙醇至6 ml，依次加入5 %NaNO2溶液1.00 ml，充分混勻后靜置6 min，加入10 %AlCl3溶液1.00 ml，充分混勻后靜置6 min，最后加入4 %NaOH溶液10 ml，并加無水乙醇定容至刻度，充分混勻后靜置15 min[5]。以試劑空白為參比溶液，于506 nm處測各對照品溶液的吸光度[6]。以蘆丁對照品質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標建立對照曲線。回歸方程為A=0.0916C-0.0148，R2=0.9966，表明蘆丁對照品溶液在4.00～40.00 μg/ml范圍內濃度與吸光度的線性關系良好。

2.1.2 馬鞭草總黃酮提取工藝流程 取馬鞭草段（約為2 cm），準確稱定，按設計好的實驗條件進行超聲提取，濾過，濾液減壓回收乙醇并繼續減壓濃縮成稠膏，備用。

2.1.3 馬鞭草總黃酮提取的單因素試驗

2.1.3.1 超聲時間對馬鞭草總黃酮含量的影響 準確稱取馬鞭草段20 g，固定液料比為30:1，乙醇體積分數為60 %，考察超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.3.2 液料比對馬鞭草總黃酮含量的影響 準確稱取馬鞭草段20 g，固定超聲時間為30 min，乙醇體積分數為60 %，考察液料比分別為10:1，20:1，30:1，40:1，50:1，60:1條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.3.3 乙醇體積分數對馬鞭草總黃酮含量的影響 準確稱取馬鞭草段20 g，固定超聲時間為30 min，液料比為30:1，考察乙醇體積分數分別為40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.4 超聲法提取工藝的響應面優化[7]在單因素試驗結果的基礎上，以馬鞭草總黃酮的含量（Y）為響應值，選取超聲時間(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分數(X3)為影響因素，采用三因素三水平的試驗設計進行Box-Behnken中心組合試驗。響應面試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 馬鞭草總黃酮提取響應面試驗設計因素水平及編碼

2.2 馬鞭草總黃酮體外抗氧化試驗

2.2.1 馬鞭草總黃酮對DPPH的清除能力[8]將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5，10，20，40，60，80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 ml，充分混勻，25 ℃下避光反應30 min，以無水乙醇為空白對照，于517 nm波長處測定其吸光度，平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照，精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應濃度，按上述方法操作。

DPPH自由基清除率（%）=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100 %

其中：A樣品為樣品溶液2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度；A空白為樣品溶液2 ml+無水乙醇2 ml的吸光度；A對照為無水乙醇2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度。

2.2.2 馬鞭草總黃酮對H2O2的清除能力[9]將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5，10，20，40，60，80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中，加入2.5 %的H2O2溶液2 ml，充分混合，靜置15 min，以蒸餾水為空白對照，于230 nm處測定其吸光度，平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照，精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應濃度，按上述方法操作。

H2O2清除率（%）=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100 %

其中：A樣品為樣品溶液2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度；A空白為樣品溶液2 ml+無水乙醇2 ml的吸光度；A對照為無水乙醇2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 超聲時間的影響 超聲時間對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 超聲時間對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響

由圖1可見，在液料比30:1，乙醇體積分數60 %的條件下，隨著超聲時間的延長，馬鞭草總黃酮含量先增加后減小，在40 min時總黃酮含量最高，40～60 min含量降低。這可能是由于隨著超聲時間的延長，馬鞭草中總黃酮在不斷溶出，在40 min時提取較完全，再增加超聲時間會使黃酮類物質破壞且增加雜質的溶出，降低總黃酮含量。因此，超聲時間為40min時最佳。

3.1.2 液料比的影響 液料比對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖2。

由圖2可見，在超聲時間為30 min，乙醇體積分數60 %的條件下，隨著液料比的增加，提取物中馬鞭草總黃酮含量先增加后減少，在液料比40:1時總黃酮含量最高。這主要是由于前期溶劑量的增多，增大了溶劑與溶質的接觸面積，使有效成分浸出完全。當細胞內外達到擴散平衡時，黃酮不再浸出，此時總黃酮含量最高，再增加溶劑的量將不會提高總黃酮含量，反而浪費溶劑，為之后的蒸發濃縮帶來困難。因此，液料比為40:1時最佳。

圖2 液料比對馬鞭草總黃酮含量的影響

3.1.3 乙醇體積分數的影響 乙醇體積分數對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對馬鞭草總黃酮含量的影響

由圖3可見，在超聲時間30 min，液料比30:1的條件下，隨著乙醇體積分數的增加，馬鞭草總黃酮含量先增加后減少，在乙醇體積分數為60 %時總黃酮含量最高。但當乙醇體積分數繼續增加時，會使脂溶性雜質如色素等的溶出量增加，降低總黃酮的含量，并且不易進行后期的分離純化。因此，乙醇體積分數為40:1時最佳。

綜上，選取單因素的提取條件為：超聲時間40 min，液料比40:1，乙醇體積分數60 %。

3.2 響應面分析法試驗結果

以單因素試驗結果為基礎，根據表1的設計因素水平與編碼，采用Box-Behnken中心組合實驗原理對馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝進行響應面法優化，以超聲時間（X1）、液料比（X2）、乙醇體積分數（X3）為影響因素，馬鞭草總黃酮含量（Y）為響應值進行三因素三水平試驗，設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案與結果

將所得數據通過Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合，得到的二元多項回歸方程為：

回歸方程分析見表3。

表3 回歸方程方差分析

由表3可見，模型組的F值為207.91，模型差異極顯著（P＜0.01）。一次項X1、X2、X3對模型的影響均極為顯著（P＜0.01），R2=0.9963，數據表明所選取的模型相關度較好，可行性強。由F值可得各個因素對馬鞭草總黃酮含量影響的大小順序：乙醇體積分數（X3）＞液料比（X2）＞超聲時間（X1）。

通過Design-Expert 8.0軟件對超聲時間（X1）、液料比（X2）、乙醇體積分數（X3）各因子間的交互作用進行分析，得到了圖4～圖6的響應面和等高線圖。響應面圖中，響應面越陡峭，則該因素對響應值的影響越顯著；相反則該因素影響不顯著。在等高線圖中，可直接觀察到各影響因子交互作用程度，等高線接近于圓形，影響因子交互作用不強；相反，等高線接近于橢圓形，說明兩個影響因子間的交互作用較強[10]。由圖4、圖6可見超聲時間（X1）與液料比（X2）、液料比（X1）與乙醇體積分數（X3）的等高線接近于橢圓，說明超聲時間（X1）與液料比（X2）及液料比（X1）與乙醇體積分數（X3）有較強的交互作用。由圖5可見超聲時間（X1）與乙醇體積分數（X3）的等高線接近于圓形，說明超聲時間（X1）與乙醇體積分數（X3）交互作用較小。

圖4 提取時間和液料比對總黃酮含量的響應面和等高線分析圖

圖5 提取時間和乙醇體積分數對總黃酮含量的響應面和等高線分析圖

圖6 液料比和乙醇體積分數對總黃酮含量的響應面和等高線分析圖

3.3 最佳提取工藝及驗證試驗

響應面法得到的最佳提取工藝為：超聲時間40 min，液料比50:1，乙醇體積分數60 %，提取物中馬鞭草總黃酮含量的預測值為3.31 %。對最佳提取工藝為進行驗證，得到馬鞭草總黃酮含量的平均實測值為3.26 %（n=3），實測值與預測值的誤差為1.51 %[11]，說明響應面法得到的最佳提取工藝有較強的可行性。

3.4 馬鞭草總黃酮清除DPPH的能力

以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質量濃度（μg/ml）為橫坐標，DPPH的清除率（%）為縱坐標繪制曲線，見圖7。由圖7可見，5～20 μg/ml濃度范圍內，馬鞭草總黃酮的清除率小于抗壞血酸（P＜0.05），但隨著濃度的增加，40～80 μg/ml濃度范圍內馬鞭草總黃酮的清除率大于抗壞血酸（P＜0.05）。

圖7 馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基的能力

3.5 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質量濃度（μg/ml）為橫坐標，H2O2的清除率（%）為縱坐標繪制曲線，見圖8。由圖8可見，馬鞭草總黃酮和抗壞血酸清除H2O2能力均與質量濃度成正比，馬鞭草總黃酮對H2O2的清除作用大于抗壞血酸（P＜0.05）。

圖8 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

4 討論

4.1 馬鞭草具有多種活性成分，其中黃酮類化合物的研究逐漸被大家所重視。本項目組采用超聲法提取馬鞭草總黃酮，提取效率高，成分破壞少，并用響應面法優化馬鞭草總黃酮的提取工藝，得到最佳提取條件為超聲時間40 min，液料比50:1，乙醇體積分數60 %。根據驗證試驗得到的實測值為3.26 %，與預測值3.31 %的誤差為1.51 %，說明該提取工藝有較強的可行性。

4.2 通過測定馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基和H2O2的能力，表明其具有較強的體外抗氧化活性。

4.3 通過上述研究，確定了馬鞭草總黃酮的最佳提取工藝，為其全面開發與利用提供理論依據；同時，馬鞭草總黃酮具有較好的抗氧化能力，可作為保健品及化妝品的原料，有較好的開發前景。